摘要[目的]通过对黑龙江省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株进行分离鉴定,基于PEDV分离株S、ORF3基因序列进行遗传进化分析,丰富现有PEDV材料,为猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)的防治及疫苗研发提供参考依据.[方法]采集养猪场疑似猪流行性腹泻病料,利用Vero-E6细胞进行适应性培养获得病毒,并通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)对毒株进行分离鉴定.通过PCR分别扩增PEDV分离毒株的S1、S2和ORF3基因,构建重组质粒并测序鉴定,获得PEDV分离株的S、ORF3基因序列.将分离株与26株参考毒株的S和ORF3基因序列进行核苷酸序列相似性比对和遗传进化分析,确定分离毒株的所属亚群.[结果]在Vero-E6细胞上培养分离的PEDV毒株,感染细胞出现变形圆缩、折光性降低,细胞发生融合,后期细胞脱落出现空斑等典型细胞病变;RT-PCR和IFA检测显示,扩增均出现片段大小约600 bp的特异性条带,分离株感染细胞后均可与PEDV N蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明分离的3株病毒株均为PEDV,分别命名为HLJ、HLJ2020和HLJ2021株.成功构建PEDV各分离株的S1、S2和ORF3基因重组质粒并测序获得相应基因序列.核苷酸序列相似性比对与遗传进化树分析结果显示,PEDV HLJ与HLJ2020 株为GⅠb亚群毒株,PEDV HLJ2021株归入GⅡc亚群.[结论]本研究从黑龙江地区腹泻猪小肠组织中成功分离获得3株PEDV流行毒株,其中分离毒株PEDV HLJ与PEDV HLJ2020属于GⅠb亚群,PEDV HLJ2021株属于GⅡc亚群.