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弓形虫表面抗原IMP1的克隆原核表达及免疫学鉴定

Cloning,prokaryotic expression and immunological identification of Toxo-plasma surface antigen IMP1

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摘要目的：克隆刚地弓形虫强毒RH株的表面抗原免疫作图蛋白1（Immune mapped protein?1，IMP1），并对其进行原核表达纯化、鉴定。方法采用逆转录法合成刚地弓形虫RH株的第一链cDNA，以此为模板，用PCR法扩增野生型IMP1基因的最大开放阅读框（ORF）序列，TA克隆测序鉴定后，插入原核表达载体pET28b中，构建重组表达载体pET28b?IMP1，经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），经异丙基硫代?β?D?半乳糖苷（IPTG）诱导表达携带6×组氨酸标签的IMP1融合蛋白，改变温度、诱导时间和IPTG浓度以优化诱导表达条件并测定蛋白可溶性，通过镍离子螯合（Ni2+?NTA）亲和层析纯化IMP1融合蛋白，经Western blotting验证重组蛋白的特异性。结果在弓形虫RH株速殖子cD?NA中成功调取了IMP1基因的ORF序列，并通过TA克隆和测序鉴定了IMP1基因的正确性，在此基础上构建了原核表达重组质粒pET28b?IMP1，经双酶切和测序验证了重组载体的正确性，并通过条件筛选确定了IMP1的最佳表达条件为20℃下0.3 mmol/L IPTG诱导9 h。经镍柱亲和层析纯化后，IMP1全蛋白表达量和可溶性均较好，与镍柱填料有较高的亲和力，能实现高效纯化。经SDS?PAGE及Western blotting鉴定，IMP1具有良好的免疫活性。结论新型强毒弓形虫RH株的表面抗原IMP1可在大肠杆菌原核表达系统中高效表达，全长蛋白可溶，性状稳定。本研究为进一步制备IMP1多克隆抗体，进行后续的体内表达研究以及抗弓形虫感染亚单位疫苗的构建和IMP1晶体结构研究奠定了基础。