CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(PCR-Taqman探针法)的方法学验证

Method validation of CHO host cell residual DNA quantitative kit (PCR-Taqman probe)

二维码有效期 120s

摘要目的:中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞DNA残留检测(PCR-Taqman探针法)方法的验证.方法:利用磁珠分离法结合Taqman探针定量PCR技术,对自主研制的CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限、参考品DNA标定等验证.特别针对残留定量限、蛋白浓度、pH值、缓冲体系等关键影响因素,以及生产工艺各中间品进行回收率考察,验证试剂盒对复杂样品的检测性能.选取采用不同工艺的多个重组蛋白产品,通过独立三方协作标定,开展试剂盒的适用性研究.结果:DNA标准曲线在3fg· μL-1～ 300 pg· μL-1范围内,线性良好(R2＞ 0.99);对5个浓度梯度检测的准确度偏差均＜10％;定量限为0.5 fg· μL-1;内部参考品DNA标定结果为10 μg· mL-1;精密度良好(RSD≤15％);大鼠、小鼠、大肠杆菌、人类基因组DNA对检测无干扰.另外,对于样品中DNA含量在1pg· mL-1～ 10 ng· mL-1、pH值在4～9,采用磷酸缓冲体系、Tris缓冲体系、醋酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系等多种基质样品,以及生产工艺中间品的检测回收率均在70％～130％,RSD均＜15％.3个独立实验室间协标检测数据RSD均＜30％.结论:自主研发CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒(荧光探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足复杂基质条件下各种重组制品的宿主DNA残留检测要求.