MiR-375抑制的人诱导多能干细胞分化为起搏样细胞的研究

Experimental research on the differentiation of miR-375-inhibited human-induced pluripotent stem cells into pacemaker cells

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摘要目的探讨抑制miR-375表达能否使其修饰的人诱导多潜能干细胞(hiPSC)在向hiPSC源性心肌细胞(hiP-SC-CMs)分化的过程中更高效地向起搏样细胞转化.方法采用hiPSC时序性激活或抑制Wnt信号通路定向诱导分化到hiPSC-CMs,流式分析检测其分化效率.分别转染携带miR-375抑制剂和绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒rLV-ZsGreen-Puro-hsa-mir-375 inhibitor(miR-375组)和等量带GFP的空载慢病毒(GFP组),空白组不做转病毒处理(Null组).分化14 d后在倒置显微镜下计算各组细胞每分钟搏动次数,采用实时荧光聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹检测三组起搏细胞发育相关转录因子(Shox2、Nkx2.5、Isl1)、起搏相关离子通道超极化激活环核苷酸门控通道4型(HCN4)mRNA和蛋白水平变化,采取免疫荧光法检测GFP组和miR-375组Shox2蛋白和心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTNT)的表达.结果分化第7 d起可见细胞自发性搏动,流式分析结果cTNT阳性率超80％,hiPS-Cs成功诱导分化到hiPSC-CMs;与GFP组和Null组比较,miR-375组搏动速度及Shox2、HCN4、Isl1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,Nkx2.5表达明显降低(P<0.05);荧光显微镜观察miR-375组Shox2蛋白表达强于GFP组,cTNT蛋白表达两组无显著差异.结论通过抑制miR-375表达能增加hiPSCs向起搏样细胞的分化效率.