鸽Ⅰ型腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

Development of a SYBR Green Ⅰ real-time PCR for detection of pigeon type Ⅰ adenovirus

二维码有效期 120s

摘要为建立鸽Ⅰ型腺病毒(PIAdV-Ⅰ)的快速检测方法,本研究根据PIAdV-IFiber2基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了快速检测PIAdV-Ⅰ的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)方法.建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的标准曲线结果显示,重组质粒标准品pMD19-Fiber在1×103 拷贝/μL～1×108拷贝/μL时和Ct值之间的线性关系良好,相关系数R2=0.995,扩增效率为90％.利用建立的qPCR方法对鸽Ⅱ型腺病毒(PIAdV-Ⅱ)Fiber 2基因保守区质粒标准品、鸽圆环病毒(PICV)、新城疫病毒(NDV)、多杀性巴氏杆菌(PM)和禽致病性大肠杆菌(APEC)的检测结果均为阴性,仅PIAdV-Ⅰ检测为阳性,特异性强;该方法对浓度为1×100拷贝/μL～1×108拷贝/μL的重组质粒标准品进行检测,结果显示最低检测限为1×102拷贝/μL,而普通PCR最低检测限为1×104拷贝/μL,表明qPCR方法的敏感性更强;该方法批内、批间重复性试验的变异系数分别小于1％和2％,重复性好.利用建立的qPCR方法和普通PCR方法对从呼和浩特市某赛鸽公棚随机采集的30份鸽肝脏样品进行PIAdV-Ⅰ检测,结果显示前者的阳性检测率为63.3％(19/30),普通PCR方法的阳性率为36.7％(11/30),两种方法的阳性符合率均为100％.本研究首次建立PIAdV-Ⅰ的qPCR检测方法,为鸽PIAdV-Ⅰ的感染提供了敏感、快速的检测手段.