摘要有报道证实,缺失重要功能基因EP152R的非洲猪瘟病毒(ASFV)不能有效复制.为了筛选靶向ASFV EP152R基因的小向导RNA(sgRNA),分析EP152R基因对ASFV复制的影响,本研究利用簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR-Cas9)核酸酶系统(CCTop)并利用猪的基因组作为脱靶对象设计并筛选靶向ASFV EP152R基因(72387nt～72845nt)的sgRNA,并采用非随机整合报告系统(TIDE)计算各对sgRNA的编辑效率确定最佳sgRNA.结果显示,筛选了5对靶向敲除ASFV EP152R基因的sgRNA,其中3对sgRNA对EP152R基因的编辑效率达30%～42%,另外两对sgRNA的编辑效率低于10%.将筛选的3对sgRNA退火后分别克隆至p-LentiCRISPRv2载体中,构建3个重组慢病毒质粒p-LentiCRISPRv2-gREP152R-1/2/3,并采用菌液PCR及测序鉴定正确后分别与2个辅助质粒共转染HEK293T细胞,72 h后获得各慢病毒并分别感染野猪肺细胞(WSL细胞),通过嘌呤霉素筛选表达各sgRNA的细胞WSL-gREP152R,并采用western blot鉴定.结果显示,构建的各细胞在40 ku处均出现特异性条带,而WSL细胞无该条带,表明正确构建表达3种EP152R sgRNA的细胞系WSL-gREP152R-1/2/3.将携带mCherry报告基因的重组ASFV(mCherry-ASFV)以MOI 1感染各WSL-gREP152R细胞系,分别于不同时间观察荧光;收集各细胞上清液,采用荧光定量PCR(qPCR)检测ASFV P72基因的Ct值,并测定上清液中的病毒效价(感染后72 h).观察结果显示,随感染时间的延长WSL-gREP152R-2/3中的红色荧光均明显减少;WSL-gREP152R-1及空白对照WSL细胞中的红色荧光则逐渐增多,但前者的红色荧光均少于后者.qPCR和TCID50测定结果显示,与空白对照WSL细胞相比,3种WSL-gREP152R细胞上清液中病毒扩增的Ct值均显著或极显著升高(P<0.05、P<0.01),而病毒效价均显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01),且以WSL-gREP152R-2中的病毒效价最低.将mCherry-ASFV感染各WSL-gREP152R细胞并连续传3代,采用qPCR检测F2、F3代细胞上清液中的病毒扩增的Ct值.结果显示,与WSL细胞相比,各WSL-gREP152R细胞F2代上清液中ASFV扩增的Ct值均极显著升高(P<0.01),且WSL-gREP152R-2 F2代及WSL-gREP152R-1/2 F3代细胞上清液中均检测不到病毒扩增的Ct值.上述结果表明,本研究设计的sgRNA能够有效靶向ASFV EP152R基因并敲除该基因进而抑制ASFV及其子代病毒的复制,且gREP152R-2抑制ASFV复制的效果最好.本研究为ASFV疫苗的开发及抗ASF育种猪提供重要参考数据.