摘要为比较不同启动子驱动的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)强毒株ZJ-JX-2015感染性克隆拯救的各重组病毒的效率,本研究将ZJ-JX-2015株全基因组引入无义突变位点(C-G,形成BstB I酶切位点)作为后期鉴定标签并分成4段经PCR扩增后,分别克隆至含CMV启动子的pSMART-BAC载体和含T7启动子的pWSK-29载体中构建感染性克隆质粒pSMART-BAC-CMV-rPRRSV和pWSK-29-T7-rPRRSV,经PCR及测序鉴定正确后将前者分别转染BHK-21和293T细胞;将后者转染BHK-21(T7)细胞.48 h后收集上述各细胞上清液接种Marc-145细胞并连续传10代.通过观察细胞病变(CPE),收集不同代次Marc-145细胞上清液经PCR及间接免疫荧光试验(IFA)鉴定拯救的各重组病毒.将拯救的各重组病毒以MOI 0.1接种Marc-145细胞,通过测定不同时间各病毒上清液的病毒效价(TCID50)绘制生长曲线.结果显示,各细胞上清液[BHK-21、293T细胞及BHK-21细胞(T7)]在Marc-145细胞中传至第2代时均出现CPE;PCR及测序鉴定结果显示,各代次的各组Marc-145细胞上清液均能扩增到544 bp的目的片段,且均含遗传标记BstB I酶切位点.IFA结果显示,上述各代次各组Marc-145细胞上清液接种的各细胞中均出现绿色荧光,对照Marc-145细胞无绿色荧光.上述结果表明,拯救了3株重组PRRSV:BHK-rJX15、293T-rJX15(分别转染BHK21及293T细胞所得)及T7-rJX15株[转染BHK-21(T7)细胞所得],且各病毒的遗传稳定性较强.测定各病毒TCID50并绘制各病毒生长曲线,结果显示,在各病毒的感染后期(感染后72 h),BHK-rJX15株的病毒效价显著高于亲本病毒(P<0.05),极显著高于T7-rJX15及293T-rJX15株(P<0.01);293T-rJX15的病毒效价极显著高于T7-rJX15株(P<0.01),但这两株病毒的效价又极显著低于亲本病毒(P<0.001).且4株病毒的生长趋势基本一致.上述结果表明CMV启动子驱动的重组PRRSV(BHK-rJX15和293T-rJX15)复制水平高于T7启动子驱动的重组病毒(T7-rJX15),尤以CMV启动子驱动并通过BHK细胞拯救的重组病毒(BHK-rJX15)复制水平最高.提示,CMV启动子更适用于构建PRRSV的反向遗传操作系统.本研究为构建PRRSV反向遗传操作系统及其蛋白功能研究、新型疫苗的研发奠定了基础.