换一批牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用
Establishment and application of duplex TaqMan real-time PCR for Mycoplasma bovis and Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides
摘要牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分.为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1 742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的TaqMan荧光定量PCR检测方法.特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强.分别以1.0×107拷贝/μL～1.0×101拷贝/μL的pEASY-Mmm和pEASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×101拷贝/μL,敏感性较高.对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5％,重复性较好.利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性.本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重TaqMan荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段.
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分类号
S852.6
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1008-0589.202310015
发布时间
2024-06-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
重要新发与外来动物疫病口岸检疫新型检测技术研究（2021YFD1800503）；
中国农业科学院科技创新工程项目
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