摘要为构建牛病毒性腹泻病毒(BVDV)囊膜蛋白E2重组腺病毒并分析其免疫效果.本研究通过PCR扩增获得目的基因BVDV E2,将其与穿梭载体pDC316-CMV-EFla-copGFP连接得到重组腺病毒载体,抽提质粒后酶切鉴定.将目的质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox-?E1,3cre采用AdMax系统共转染至Low Passage 293细胞中得到重组腺病毒rAdv-E2,同时包装重组腺病毒rAdv-EGFP用于阴性对照并均经PCR和测序鉴定;将重组腺病毒rAdv-E2和rAdv-EGFP分别感染Low Passage 293细胞后扩繁,并采用RT-PCR和TCID50检测目的基因的表达及腺病毒滴度;将BVDV E2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,使用IPTG诱导表达后经Ni-NTA琼脂糖树脂纯化获得重组E2蛋白(rE2),用于后续特异性抗体的检测;以1×108 TCID50/只分别将重组腺病毒rAdv-E2和rAdv-EGFP经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,分别于第0、14 d两次免疫,首免后分别于7 d、14 d、21 d、28 d断尾采血,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清抗体水平;于首免后21 d时分别以BVDV TC株攻毒,于攻毒后0、5 d、10 d及15 d从各组小鼠中随机剖杀3只,取肝脏、肺脏、肾脏组织,使用福尔马林溶液固定小鼠各组织后,经脱水浸蜡、包埋、切片、HE染色后观察攻毒后各组小鼠的组织病理变化情况.结果显示,RT-PCR鉴定结果表明重组腺病毒rAdv-E2表达E2基因;ELISA检测结果显示,rAdv-E2组小鼠在免疫后7 d、14 d、21 d时抗体水平升高,28 d时显著升高,rAdv-EGFP组小鼠抗体水平无明显变化,rAdv-E2组小鼠的抗体水平整体极显著高于rAdv-EGFP组(P<0.001、P<0.0001),表明rAdv-E2诱导小鼠产生了良好的体液免疫反应;组织病理切片观察结果显示,BVDV攻毒后,接种rAdv-EGFP的对照组小鼠肝脏组织出现肝细胞变性坏死、水肿、炎性细胞增多,中央静脉有淤血产生;肺脏组织病变特征主要为肺泡破裂融合,炎性细胞浸润、出血、充血,黏膜脱落;肾脏组织有炎症产生,出现淋巴细胞浸润等病变特征,rAdv-E2免疫组小鼠各组织仅出现较轻的细胞病变,表明重组腺病毒rAdv-E2可以保护BALB/c小鼠免受BVDV的感染而致病.综上结果表明,重组腺病毒rAdv-E2将有望成为防控BVDV感染的新型疫苗.