摘要为分析本研究前期分离的大肠杆菌噬菌体Hab-EA株是否编码裂解酶(Lysin)基因,且该裂解酶蛋白是否对大肠杆菌(E.coli)具有杀菌活性,本研究根据GenBank中大肠杆菌噬菌体lysin基因序列,采用Primer 5设计简并引物,经PCR扩增Hab-EA株的假定裂解酶(称为lysEha1)基因并测序,分别采用ORF Finder和BLAST分析该基因的ORF,采用SWISS模型预测该ORF编码Lysin蛋白的空间结构.对已确定的lysEha1 ORF序列设计表达引物.以简并引物经PCR扩增的产物为模板,采用表达引物经PCR扩增lysEha1基因完整的ORF,构建原核表达载体pET-30a(+)-lyEha1-ORF,经PCR和测序鉴定正确后通过原核表达系统表达并经Ni亲和层析柱法纯化LysEha1 ORF(即重组裂解酶蛋白rLysin),利用SDS-PAGE与western blot鉴定该蛋白的表达与纯化效果.简并引物的PCR结果显示,扩增到约1 200 bp的目的条带,测序结果经O RF Finder分析显示:该片段的nt39～nt536存在一个498 bp的ORF;BLAST分析显示,该ORF属于大肠杆菌噬菌体Lysin家族基因.Lysin蛋白的二级结构含7段α螺旋,3段β折叠.表达引物的PCR结果显示在约500 bp处出现目的片段,测序结果显示该ORF为噬菌体lysin基因.SDS-PAGE和western blot结果均显示,在约25 ku处出现特异性目的条带,且rLysin主要在上清中表达,纯化后可见单一目的条带.采用浊度递减试验测定rLysin及其与EDTA联用(rLysin+EDTA)后分别对16株E.coli的杀菌活性.结果显示,rLysin对16株致病性大肠杆菌的总杀菌率为56.25％(9/16),rLysin+EDTA对上述细菌的总杀菌率达87.5％(14/16),rLysin+EDTA的杀菌率显著高于rLysin(P＜0.05).上述结果表明,噬菌体Hab-EA株可编码Lysin,本研究正确表达并纯化了该rLysin,并证实其对致病性大肠杆菌的杀菌活性较强,与EDTA联用可以提高rLysin对致病性大肠杆菌的杀菌活性.本研究为致病性大肠杆菌病的防控提供新的思路与途径.