摘要为建立基于逆转录重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)结合侧向流层析试纸条(LFD)的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的可视化快速检测方法,本研究由通用生物有限公司合成IBV N基因片段并克隆至pUC57载体,构建重组质粒pUC57-IBV-N,经测序鉴定正确后作为质粒标准品.以IBVN基因保守序列设计3对特异性引物,将1.0×104拷贝/μL的质粒标准品作为模板,将不同组合的引物经PCR扩增,以筛选最优引物.结果显示,除了 IBV-NF3/NR3引物的扩增产物出现非特异性条带外,其余2对引物均能有效扩增目的片段.在此基础上,基于RAA反应体系修饰引物和设计探针,以104拷贝/μL的质粒标准品作为模板,经基础RT-RAA-CFD反应,筛选最优引物探针组合.结果显示,RAA-NF1/NR1/NP1为最优引物和探针组合,采用单一变量法优化引物探针终浓度、反应温度及反应时间,结果显示,引物探针终浓度均为2μmol/L、38℃反应10 min为最佳反应条件,此时在反应体系中插入LFD,根据其质控线(C线)与检测线(T线)的显色情况判定结果,初步建立了 IBV可视化的RT-RAA-LFD检测方法.采用建立的RT-RAA-LFD检测IBV、新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒和禽腺病毒,结果显示仅IBV为阳性,其他病原均为阴性结果,特异性较强;以10倍倍比稀释(1.0×100拷贝/μL～1.0×106拷贝/μL)的质粒标准品pUC57-IBV-N为模板,采用建立的RT-RAA-LFD检测,结果显示该方法的检测限达1.0×100拷贝/μL,敏感性较高.以不同拷贝数浓度的重组质粒标准品为模板,分别于不同时间点利用该方法检测,结果显示,上述重复性试验结果均一致,重复性较好.利用该方法和常规RT-PCR检测28份(分别为14份IBV阳性、14份阴性样品)咽喉拭子样品,结果显示该方法与RT-PCR的检测结果完全一致.综上所述,本研究建立的RT-RAA-LFD方法具有耗时短、特异性强、敏感性高、重复性好、设备要求低等优势,为IBV的现场快速检测、早期筛查和流行病学调查提供了可靠的技术手段.