摘要为建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速检测方法,本研究利用真核系统表达后纯化与浓缩的ASFV重组CD2v蛋白(rCD2v)免疫BALB/c小鼠4次,采用杂交瘤技术制备ASFV CD2v蛋白单克隆抗体(MAb).结果显示,共获得5株稳定分泌ASFV rCD2v MAb的杂交瘤细胞株.制备小鼠腹水,利用Protein A/G亲和层析柱纯化制备的小鼠MAb腹水,经SDS-PAGE电泳检测MAb的纯化效果,使用分光光度计测定纯化MAb的浓度,利用间接ELISA方法检测不同浓度MAb的效价.结果显示,5株纯化的MAb均分别在约55 ku(重链)和25 ku(轻链)处分别出现单一目的条带,且MAb的浓度均值为1.02±0.15mg/mL.效价检测结果显示,除最低浓度外,其余浓度的5株MAb的OD450nm值均大于0.2,其中MAb 11E2的OD450nm值最高.采用过碘酸钠法将5株MAb标记HRP(MAb-HRP),经ELISA法检测标记效果及效价,将5株MAb与5株MAb-HRP两两组合后经双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测,以确定最佳的配对抗体.结果显示,5株纯化的MAb均标记上HRP,当以MAb 6D9作为捕获抗体,MAb 11E2-HRP作为检测抗体时的P/N值最高,因此采用这两种MAb配对进行后续实验.采用棋盘滴定法优化DAS-ELISA的反应条件,优化结果显示,MAb 6D9的最佳浓度为2μg/mL、rCD2v的最佳包被浓度为2.5 μg/mL、MAb 11E2-HRP的最佳稀释度为1∶400,初步建立了检测ASFV的DAS-ELISA方法.利用建立的DAS-ELISA检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、伪狂犬病病毒和ASFV,评估本研究建立方法的特异性;利用该DAS-ELISA方法检测2倍倍比稀释的ASFV rCD2v(2 μg/mL～0.004 μg/mL),评估该方法的敏感性;采用同一批次和不同批次rCD2v包被的酶标板,经DAS-ELISA方法分别检测3份ASFV猪阳性血清和1份ASFV猪阴性血清,评估该方法的重复性.结果显示,该方法仅能检测ASFV,其他常见的猪源病毒均为阴性结果,特异性强;该方法对rCD2v的检测限为0.0156μg/mL,敏感性高;批内和批间重复性试验的变异系数均在10％以下,重复性好.采用建立的DAS-ELISA与荧光定量PCR(qPCR)分别检测192份疑似ASFV感染的临床灭活猪血清样品.结果显示DAS-ELISA检出108份阳性样品,84份阴性样品;qPCR检出112份阳性样品,80份阴性样品.经计算两种方法的阳性符合率和总符合率分别为96.4％(108/112)与97.9％(188/192).上述结果表明,本研究建立的DAS-ELISA方法适用于ASFV大规模临床猪血清样品的检测,为ASFV的检测及流行病学调查提供技术支撑.