青蛤源溶藻弧菌的分离鉴定、药敏分析以及中草药体外抑菌研究
Isolation,identification,and antibiotic susceptibility analysis of Vibrio alginolyticus from Cyclina sinensis and in vitro antibacterial effect of Chinese herbal medicine
摘要为探究江苏盐城射阳县养殖青蛤(Cyclina sinensis)发病死亡的病原体,并了解该病原体的药物敏感性和中草药体外抑菌效果,本研究从患病濒死的青蛤病鳃中分离到1株优势菌VP3,对其形态特征、革兰氏染色、生化特性鉴定及16S rRNA基因序列扩增与分析,结果显示该分离菌为革兰氏阴性短杆菌,且菌落形态和生理生化特征均与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)相似性较高;PCR法扩增分离菌的16S rRNA基因,经序列分析及构建系统发育树,结果显示其与溶藻弧菌(OP 853047.1)聚为一支,相似性为100%.对分离株VP3进行人工回归感染试验,结果显示,该分离菌对青蛤的半数致死量(LD50)为4.5×106 cfu/mL,且可从患病青蛤鳃组织中再次分离获得与分离菌形态及生化特征均一致的菌株,对人工回感青蛤的各个组织制备病理切片,观察结果显示,病变特征与自然感染的患病青蛤基本一致.进一步表明引起该地区青蛤发病的病原为溶藻弧菌.采用K-B纸片扩散法测定分离菌对9类共27种药物的敏感性,结果显示,分离菌VP3对多西环素等22种抗生素敏感.采用牛津杯法测定68种单方中草药对分离菌的抑菌效果,结果显示,乌梅等20种单方中草药对分离菌具有抑菌效果,其中,乌梅、诃子、酒萸肉、苏木和五倍子对分离菌的抑菌效果最好.采用微量肉汤稀释法测定具有抑菌效果的20种单方中草药的最小抑菌浓度(MIC),同时采用菌液涂布法测定各单方中草药的最小杀菌浓度(MBC),结果显示,丁香、苏木、诃子和乌梅对分离菌的抑菌效果较好,MIC和MBC值分别为15.63 mg/mL和31.25 mg/mL.选取苏木、乌梅、五倍子和诃子中草药液,分别制备二联复方中草药液和4种三联中草药液,采用牛津杯法检测各复方中草药的抑菌效果.结果显示,乌梅+诃子、诃子+五倍子、乌梅+五倍子二联中草药复方的抑菌效果最好,乌梅+诃子+五倍子三联中草药复方对分离菌的抑菌作用最好.综上所述,本研究分离到一株致病菌溶藻弧菌VP3,并首次筛选出对其具有抑菌作用的单方和复方中草药,为青蛤源溶藻弧菌感染的诊断与防治提供参考依据,同时为研制防控青蛤弧菌病专用中草药提供参考依据,助力青蛤养殖绿色高质量发展.
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