摘要为建立同时快速检测奶牛繁殖障碍性疾病相关病毒牛疱疹病毒4型(BoHV-4)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,本研究根据BoHV-4的gL基因、IBRV的gB基因以及BVDV的5'-UTR基因设计3对特异性引物,分别构建重组质粒标准品p MD18-T-BoHV-4、pMD18-T-IBRV和pMD18-T-BVDV,经测序鉴定正确后等体积混合作为模板,采用方阵法优化反应体系和扩增条件,建立了能同时检测上述病毒的多重PCR检测方法.利用建立的多重PCR方法分别检测BoHV-4、IBRV、BVDV、牛乳头瘤病毒(BPV)、牛阿卡斑病毒(AKAV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛冠状病毒(BCOV)、牛轮状病毒(BRV)、牛细小病毒(BPV)和牛凸隆病毒(BToV),评估该方法的特异性;利用10倍倍比稀释后的3种重组质粒标准品混合物作为模板,采用建立的多重PCR方法检测,评估该方法的敏感性.结果显示,建立的多重PCR方法仅能检测到BoHV-4、IBRV和BVDV,对其他病原的检测结果均为阴性;该方法对p MD18-T-B oHV-4、pMD18-T-IBRV与pMD18-T-BVDV的检测限分别为1×103 拷贝/μL、1×103 拷贝/μL与1×102 拷贝/μL.利用本研究建立的多重PCR方法检测168份临床牛阴道拭子样品,同时利用文献发表的PCR方法和本研究室建立的qPCR方法检测,评估其临床应用的可行性,结果显示,该多重PCR对BoHV-4、IBRV和BVDV的检出率分别为22.02％(37/168)、13.69％(23/168)和17.85％(30/168);BoHV-4和IBRV的混合感染率为7.74％(13/168),BoHV-4和BVDV的混合感染率为11.31％(19/168),IBRV和BVDV的混合感染率为5.36％(9/168),BoHV-4、IBRV和BVDV的混合感染率为2.38％(4/168).PCR方法对BoHV-4、IBRV和BVDV的检出率分别为23.21％(39/168)、14.28％(24/168)和18.45％(31/168),qPCR对BoHV-4、IBRV和BVDV的检出率分别为24.40％(41/168)、14.88％(25/168)和20.23％(34/168).多重PCR与PCR和qPCR的总符合率分别为97.62％和94.64％.本研究首次建立的检测BoHV-4、IBRV和BVDV的多重PCR方法特异性强、敏感性高,且可以同时检测3种病原,为奶牛繁殖障碍疾病的早期发现、检测及流行病学调查提供了技术支撑,对临床防控奶牛繁殖障碍疾病具有重要意义.