摘要为了研制能够利用非洲绿猴肾细胞(Vero)高效培养的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M41疫苗株,本研究将适应Vero细胞的IBV Beaudette-p65株的全长基因组分成9个相互重叠的片段,经PCR扩增后测序鉴定显示获得前后含45 bp～80 bp同源基因序列的9个片段,均与预期一致.将扩增的9个cDNA片段利用环形聚合酶延伸反应(CPER)技术一步克隆至携带巨细胞病毒(CMV)启动子、丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)以及牛生长激素(BGH)多聚A(polyA)序列的BAC载体pBAC-CMV-HdvRz-BGHpolyA中,经Sap Ⅰ酶切和测序鉴定显示获得含IBV Beaudette-p65株全长基因组cDNA的感染性克隆pBAC-Beaudette.进一步利用基因无缝替换技术将Beaudette-p65株的S1基因(aa20～aa525)替换为M41株的S1基因(aa20～aa525),经PCR、Pme Ⅰ酶切和测序鉴定显示获得重组感染性克隆pBAC-Beau-S1/M41.将pBAC-Beau-S1/M41与表达Beaudette-p65株N蛋白的辅助质粒pCMV-N共转染Vero细胞拯救重组病毒,培养后观察可见典型的合胞体病变,表明拯救出表达M41株S1蛋白的重组嵌合病毒rBeau-S1/M41.将重组病毒rBeau-S1/M41在Vero细胞中连续传25代,经PCR和测序鉴定结果显示S1基因可以在重组病毒基因组中稳定存在和表达,该重组病毒具有遗传稳定性.将获得的重组病毒感染Vero细胞后每隔12 h检测其TCID50,绘制重组病毒在Vero细胞中的复制动力学曲线,结果显示,rBeau-S1/M41与亲本病毒Beaudette-p65株具有相似的复制能力.本研究首次利用CPER技术构建了可在Vero细胞中稳定传代的重组病毒rBeau-S1/M41,为研发基于Vero细胞高效培养的IBV疫苗提供了技术支撑.