Cre/LoxP系统联合SV40LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

The Establishment of the Reversed Immortalized Rat Dermatic Fibroblast Cell Line Induced by Cre/LoxP and SV40 LTag

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摘要目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法.方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体( SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞.对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力.免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性.结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P＜0.05),在体外培养传代＞25代.细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin.回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P＞0.05),无致瘤性.结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系.