共表达人kappa阿片受体与PKAcat-EGFP的CHO稳定细胞株建立及功能鉴定

Stable co-expression of human kappa opioid receptor and PKAcat-EGFP in CHO cells and functional identification

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摘要目的在中国仓鼠卵巢( Chinese hamster ovary, CHO)细胞上建立人kappa阿片受体( human kappa opioid receptor, hKOR)及增强型绿色荧光蛋白( enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的蛋白激酶A催化亚基( catalytic domain of cAMP-dependent protein kinase A, PKAcat ) 融合蛋白(PKAcat-EGFP)稳定共表达的细胞模型,为体外高通量筛选作用于hKOR的药物及药物分子机制研究打下基础.方法通过脂质体介导法将潮霉素 B 抗性的 hKOR 重组质粒[pcDNA3.1/Hygro( +)-hKOR]转染入已稳定表达 PKAcat-EGFP的CHO细胞中,随后用含潮霉素B的选择性培养基培养细胞,有限稀释法挑取耐药单克隆,PKA重分布实验筛选阳性克隆,利用Z’因子对建立的细胞模型的可靠性进行评价,利用PKA重分布实验与LANCE cAMP 384 Kit检测受体功能.结果 PKA重分布实验与LANCE cAMP 384 Kit结果表明,CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13 号克隆反应性良好,100 nmol·L-1的U-50488作用时的Z’平均值为0.596,证明了该细胞模型的可靠性,且经多次传代后的受体表达也能保持稳定.结论成功建立了hKOR与PKAcat-EGFP融合蛋白稳定共表达的细胞模型CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13.