换一批人源GRK2基因的原核表达、纯化及激酶活性检测
Prokaryotic expression,purification,and kinase activity assay of human GRK2 gene
摘要目的 构建人源G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)原核表达系统及其激酶活性测定,为GRK2互作蛋白的发现及GRK2激酶活性抑制剂的开发奠定研究基础.方法 利用基因重组技术构建PET-28a(+)-GRK2原核表达质粒并进行测序.将成功构建的原核表达质粒PET-28a(+)-GRK2转化到E.coli Rosetta(DE3)中,设置不同的诱导温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导时间,对其进行表达条件优化,使用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱进行纯化,最后使用超滤管进一步纯化,并用SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色和Western blot进行蛋白鉴定.纯化后的蛋白利用ATP酶活检测试剂盒测定GRK2激酶活性.结果 利用大肠杆菌表达系统,GRK2基因在DE3中得到成功表达,重组蛋白表达形式为部分包涵体、部分可溶性蛋白.可溶性GRK2蛋白在26℃条件下以终浓度为1 mmol·L-1 IPTG诱导6 h表达量达到最高,考马斯亮蓝染色和Western blot结果发现GRK2蛋白的相对分子质量约80 ku.大肠杆菌表达体系成功表达的GRK2蛋白具有激酶活性.结论 原核表达PET-28a(+)-GRK2质粒的序列测序正确后,PET-28a(+)-GRK2重组质粒在大肠杆菌中成功表达且表达的蛋白具有激酶活性.本实验成功构建了人源GRK2原核表达系统,表达量大,纯化方便,为后续GRK2互作蛋白的调控机制及GRK2抑制剂的开发奠定了实验基础.
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关键词
G蛋白偶联受体激酶2大肠杆菌原核表达蛋白纯化激酶活性人源蛋白G protein-coupled receptor kinase 2Escherichia coliprokaryotic expressionprotein purificationkinase activ-ityhuman protein
分类号
R341（人体生物化学、分子生物学）R345.57（人体生物化学、分子生物学）R378.21（医学微生物学《病原细菌学、病原微生物学》）R394.2（医学遗传学）R977.3（药品）R977.6（药品）
栏目名称
DOI
10.12360/CPB202505052
发布时间
2026-05-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（No82430114）
国家自然科学基金（82104187）
国家自然科学基金（82173824）
安徽医科大学第三附属医院基础与临床合作研究提升计划（No2023sfy012）
大学生创新创业训练计划项目（No202410366035）
安徽医科大学临床医学一体化)专业早期接触科研训练计划立项项目（No2023-ZQKY-163）
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