换一批
换一批电鳐乙酰胆碱酯酶单链抗体基因的克隆及表达
Gene cloning and expression of single-chain antibody against Torpedo acetylcholinesterase
摘要目的欲用计算机模拟及分子对接技术揭示抗乙酰胆碱酯酶单克隆抗体3F3抑酶的分子基础,但3F3分子远大于乙酰胆碱酯酶(AChE),难以操作,故拟用其单链抗体为工具进行研究.本研究旨在设计、克隆并表达抗AChE单链抗体Sc3F3基因,推演重组单链抗体的氨基酸顺序,并证明纯化的重组单链抗体有抑制AChE的作用.方法使用分泌抗电鳐AChE单克隆抗体3F3(3F3Ab)的杂交瘤细胞提取总RNA.用RT-PCR技术扩增重链可变区(VH)cDNA及轻链可变区(VL)cDNA基因,通过连接肽(Gly4Ser)3基因将VH基因和VL基因连接,制成单链抗体基因(ScFv).将ScFv基因插入载体pCANTAB-5E用于表达.在大肠杆菌中表达的3F3单链抗体(Sc3F3)用Sephadex G75凝胶过滤和QAE-Sephadex A-50离子交换层析纯化.AChE与抗体的免疫反应性用ELISA法测定.AChE活性用微量羟胺比色法测定.结果测序结果证明所克隆的ScFv基因是功能重排基因, 长度为723 bp.重、轻链基因长度分别为357 bp和321 bp.ScFv基因(含连接肽基因)所编码的纯化的重组Sc3F3的分子量为31.6 ku.Sc3F3与AChE反应良好,但对AChE活性的抑制明显弱于3F3Ab.Sc3F3的抑制效力约为3F3Ab的1/10.结论在计算机模拟及分子对接研究中使用本研究设计的单链抗体Sc3F3应是可靠的.
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