大鼠嘌呤能受体 P2 X4稳定表达细胞系的建立及功能的验证

Establishment of a recombinant cell line that stably expresses rat purinergic receptor P2X4 and verification of its function

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摘要目的：建立大鼠嘌呤能受体 P2 X4（rP2 X4）稳定表达细胞系，并对细胞系功能进行验证。方法构建绿色荧光蛋白rP2X4受体（pEGFP-N1-rP2X4）重组质粒，采用脂质体转染法将pEGFP-N1-rP2X4转染于人胚肾（HEK293）细胞，采用抗生素G418（1 g·L-1）压力筛选，qRT-PCR和Western蛋白质印迹法验证rP2 X4受体的表达量。全细胞膜片钳技术检测稳定表达的 rP2 X4受体Ca2＋电流。结果测序结果表明， pEGFP-N1-rP2X4重组质粒序列完全正确；采用脂质体法稳定转染HEK293细胞后，qRT-PCR和Western蛋白质印迹法结果表明，HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系在连续传代25代后（1，3，5，10，15，20和25代）rP2X4受体均保持稳定表达；全细胞电流记录实验表明，嘌呤受体激动剂ATP 3．0μmol·L-1能激活HEK293-pEGFP-N1-rP2X4细胞上表达的 rP2X4受体并产生特异性激活电流，且该电流能被非选择性P2X4受体拮抗剂三硝基苯酚（TNP）-ATP（30．0μmol·L-1）阻断。结论 HEK293-pEGFP-N1-rP2X4稳定转染细胞系上rP2 X4受体表达稳定，激活后能产生特异性激活电流。该细胞系可用于rP2 X4受体的药物筛选及其机制研究。