有机磷水解酶异源表达纯化及抗乙基对氧磷中毒能力初步评价

Heterologous expression and purification of organophosphorus hydrolases and assessment of ability to resist ethyl paraoxon poisoning

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摘要目的异源表达纯化有机磷水解酶(OPH),初步评价其动物体内抗乙基对氧磷中毒能力.方法构建OPH的大肠杆菌表达菌株,采用镍柱亲和色谱及凝胶过滤色谱进行纯化,对纯化产物进行蛋白质谱鉴定;以乙基对氧磷为底物测定酶活力及其动力学常数Km,Vmax,kcat和kcat/Km;12只SD大鼠随机分为OPH组和溶剂对照组,OPH组按1 mg·kg-1剂量iv给予OPH溶液,对照组给予等体积生理盐水,给药后2组立刻sc给予2倍半数致死量(LD50)乙基对氧磷(0.86 mg·kg-1)染毒,观察大鼠状态,对中毒症状进行评分.对存活大鼠每隔24h重复sc给予2倍LD50乙基对氧磷,根据大鼠存活情况与中毒症状分别绘制生存曲线与症状评分图,评价OPH的抗有机磷中毒能力.结果成功构建了OPH的大肠杆菌表达菌株,经过两步纯化后由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳表征得单一条带,OPH纯度较高,经蛋白质谱测定制备蛋白与目标蛋白序列一致;以乙基对氧磷为底物时,OPH的Km=7.5×10-5 mol·L-1,Vmax=2.2×10-7 mol·L-1·s-1,kcat=158.4 s-1,kcat/Km=2.1×106 L·mol-1·s-1;对照组大鼠sc给予2倍LD50乙基对氧磷后,出现严重中毒症状,15 min内全部死亡,实验组大鼠在首次染毒后均未出现中毒症状,连续染毒后中毒症状逐渐加重直至第4天全部死亡.结论成功制备高纯度OPH,且OPH在大鼠体内能有效对抗乙基对氧磷中毒.