摘要目的 探究水泡性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)修饰对工程化外泌体疫苗黏膜免疫效果的影响.方法 体外实验:将小鼠树突状细胞系DC2.4分为细胞对照组(无外泌体DMEM培养基处理)、受体结合域(RBD)组(转染RBD质粒)和RBD+VSV-G组(共转染RBD和VSV-G质粒),Western印迹法检测细胞中RBD和VSV-G蛋白表达水平,流式细胞术评价RBD和VSV-G细胞阳性率,免疫荧光染色观察RBD和VSV-G的膜定位情况;超速离心法提取外泌体,透射电镜和纳米粒子示踪分析仪分别测定外泌体的形态、粒径分布;Western印迹法验证外泌体中标志蛋白[分化群抗原9(CD9)、CD101、CD63和高尔基体蛋白亚家族A成员2(GM130)],RBD和VSV-G蛋白表达.体内实验:①将雌性BALB/c小鼠分为Mock-Exo对照组(鼻滴源自细胞对照组的外泌体)、RBD-Exo组(鼻滴源自RBD组的外泌体)和RBD+VSV-G-Exo组(鼻滴源自RBD+VSV-G组的外泌体),鼻内接种相应外泌体疫苗后,小动物活体成像观察疫苗滞留鼻组织时间,流式细胞术评价疫苗将CD49B+自然杀伤细胞、CD11c+树突细胞和F4/80+巨噬细胞招募至鼻组织的能力;初次免疫后每6d对小鼠进行称重,周期为30 d.初次免疫7d时,全自动生化仪分析小鼠血清中血尿素氮、乳酸脱氢酶、甘油三脂、谷草转氨酶、白蛋白和谷丙转氨酶含量,然后将小鼠处死,收集心、肝、脾、肺、肾和脑组织进行HE染色;②将雌性BALB/c小鼠分为Mock-Exo组、RBD+VSV-G-Exo组和RBD+VSV-G-Exo(im)组(肌肉注射RBD+VSV-G-Exo).初次免疫7d和21d时,酶联免疫吸附试验测定血清中RBD特异性免疫球蛋白G(IgG)、肺泡灌洗液和鼻腔灌洗液中RBD特异性免疫球蛋白A(IgA)的滴度.结果 体外实验:RBD和VSV-G阳性细胞率分别为64.4%与31.2%,且RBD和VSV-G蛋白成功表达在细胞膜;提取的外泌体形态规整,高表达阳性标记物CD9、CD101和CD63,不表达阴性标记物GM130,粒径约138 nm且成功装载RBD和VSV-G蛋白.体内实验:与Mock-Exo和RBD-Exo相比,RBD+VSV-G-Exo鼻组织滞留时间达96 h;鼻组织中CD49B+自然杀伤细胞、CD11c+树突细胞和F4/80+巨噬细胞含量显著增加;免疫后30d内小鼠体重呈稳定增长趋势;免疫7d后血尿素氮、乳酸脱氢酶、甘油三脂、谷草转氨酶、白蛋白和谷丙转氨酶均正常表达,心、肝、脾、肺、肾及嗅球无明显病理改变.RBD+VSV-G-Exo引起高水平的RBD特异性免疫应答,其血清中IgG滴度达1∶5 215,肺泡灌洗液中IgA滴度达1∶2 560,鼻腔灌洗液IgA滴度达1∶1 114;RBD+VSV-G-Exo(im)未在肺泡灌洗液和鼻灌洗液中检测到RBD特异性的IgA抗体滴度.结论 VSV-G修饰可延长工程化外泌体疫苗在鼻组织的滞留时间,增强其对免疫细胞的招募能力,诱导高水平的抗原特异性呼吸道黏膜免疫应答.