换一批
换一批丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用
Establishment and Application of High Throughput Screening Model for Hepatitis C Virus NS3 - 4A Protease Inhibitors in vitro
摘要目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.
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主题词
高通量筛选分析(High-Throughput Screening Assays)肝炎病毒属(Hepacivirus)蛋白(Egg White)酶抑制剂(Enzyme Inhibitors)蛋白水解(Proteolysis)
分类号
R373-33
DOI
10.3881/j.issn.1000-503X.2011.01.022
发布时间
2011-05-03
基金项目
科技部国际合作项目
国家新药创制重大专项
中央级公益性科研院所基本科研业务专项
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