基于逆转录酶活性的复制型慢病毒检测方法的建立及应用

Establishment and application of a reverse transcriptase activity assay for replication-competent lentivirus detection

二维码有效期 120s

摘要目的建立基于逆转录酶活性的复制型慢病毒检测方法,并进行方法学验证及适用性研究.方法以莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶为标准品,以噬菌体MS2 RNA 为模板,经反转录后采用 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 方法检测特异性扩增信号.对方法的专属性、线性范围、准确度、重复性、中间精密度、最低定量限、最低检出限、耐用性和适用性进行验证.结果通过优化 qPCR 引物、探针浓度及反应条件,已建立稳定灵敏的逆转录酶活性检测方法.该方法专属性良好,对 4 种类型的细胞上清样品均无特异性扩增;在 104～109 pU/μL 之间具有良好线性范围,r2＞0.99,且扩增效率处于 93%～97%;准确度回收率在 86%～102%,重复性RSD≤6%;中间精密度良好,加标样品 RSD≤4%;最低定量限为 8000 pU/μL;最低检出限为 100 pU/test;耐用性良好,RSD≤8%,回收率 89%～105%;通过指示细胞培养法接种的三类样品(CAR-T 细胞终产品样品、慢病毒载体生产终末细胞样品、慢病毒载体未加工收获液)及其病毒感染加标样品,在感染终末阶段收样后使用本方法进行逆转录酶活性检测的结果显示,三类样品均未检出复制型慢病毒,而病毒感染加标组样品均可检出病毒,方法适用性良好.结论建立了稳定可靠的基于逆转录酶活性的复制型慢病毒检测方法,各项方法学验证结果均达满意要求,且方法适用于指示细胞培养法终末阶段收样的检测,为基因治疗产品临床应用的安全性研究提供技术支撑.