改良原代大鼠骨源间充质干细胞的体外培养方法及鉴定

Improve the method of culture in vitro and identification of primary rat bone derived mesenchymal stem cells

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摘要目的改良原代大鼠骨源间充质干细胞体外分离培养方法,以获得纯度高、增殖活力强、分化潜能大的理想工程细胞.方法基于"仿原位生态培养"方法及原理,剪取大鼠前后肢股骨、胫骨,剔除附着的肌肉、筋膜组织,完全不用冲洗骨髓腔,直接将其剪碎成约1mm3骨块后,移入0.1％Ⅱ型胶原酶中消化90 min;经洗涤、离心后,接种于培养皿中进行原代培养.当细胞融合度达80％～90％时,予0.25％胰蛋白酶消化液进行二次消化,按1∶3比例进行传代培养.采用流式细胞仪检测第4代细胞表面CD分子标志物,并进行成脂、成骨诱导分化实验.结果接种48 h后,少量长梭形细胞从骨块周围爬出;96h后,细胞逐渐融合成片;传至第4代时,细胞形态均一,以"成纤维样"细长梭形为主,融合后呈"涡旋式"生长,具有一定方向性;传至第10代,细胞形态仍基本保持不变.流式细胞仪检测结果提示CD44、CD90和CD29表达阳性,CD34、CD11b/c和CD45呈阴性表达;成脂、成骨诱导分化实验均为阳性.结论基于"仿原位生态培养"原理,采用组织块结合酶消化法,能够简单、高效分离培养出大鼠骨源间充质干细胞,值得推广.