换一批小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定
Construction of lentiviral shRNA expression vector targeting mouse Ufm1 gene and identification of RNA interference efficiency
摘要目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.
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栏目名称
DOI
10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2013.10.102
发布时间
2013-09-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
上海交通大学医学院基金（(YZ1054)）
上海交通大学医学院新百人计划基金（(09XBR01)）
上海交通大学医学院附属第三人民医院基金（(syz2010-02)）
宝山区科委基金（(11-E-6)）
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