人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值

Construction and clinical applications of a humanized phage library of platelet GPⅡb/Ⅲa single chain Fv antibody

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摘要目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体, 用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库.方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者.从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT-PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断.用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1.用辅助噬菌体M13 K07援救转化后的TG1,产生ScFv.结果 95例慢性ITP患者中 41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%).2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能.扩增出380～400 bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780 bp大小的ScFv片断.ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆.用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml.结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能.用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa ScFv.