摘要目的:利用规律性重复短回文序列簇/相关基因9(CRISPR/Cas9)编辑技术构建真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因敲除的人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1细胞系。方法:设计能特异性针对4EBP1基因的特异性向导RNA(sgRNA)，以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后将重组质粒与逆转录病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2共同转入HEK 293T细胞进行慢病毒包装，收集病毒上清感染人乳腺癌MCF-7、ZR-75-1细胞。利用嘌呤霉素筛选4EBP1表达缺失的MCF-7、ZR-75-1细胞，DNA测序和Western blot验证。在MCF-7、ZR-75-1野生型与4EBP1基因敲除的细胞中转入pcDNA3-rluc-poli-IRESfluc质粒，并用双荧光素酶报告基因实验检测4EBP1、4EBP1不同突变体对帽子依赖翻译的影响，以海肾荧光素酶与萤火虫荧光素酶比值(R/F比值)来表示帽子依赖的翻译水平。R/F比值的组间比较采用t检验，两两比较采用LSD法。结果:Western blot结果显示构建的3种lentiCRISPR v2-4EBP1-KO重组质粒转染MCF-7、ZR-75-1细胞后，4EBP1蛋白的表达水平均明显降低，说明4EBP1基因敲除成功。DNA测序发现MCF-7细胞的DNA序列中sgRNA出现了T碱基的插入突变，在ZR-75-1细胞DNA序列中sgRNA出现了GC碱基的缺失突变，证明细胞基因组DNA中的基因编辑成功。野生型和4EBP1基因敲除的ZR-75-1细胞中测得的R/F比值分别为1.83±0.10和5.48±0.33，组间比较差异有统计学意义(t＝－18.338，P<0.001)。野生型和4EBP1基因敲除的MCF-7细胞中测得的R/F比值分别为1.17±0.06和2.03±0.20，组间比较差异有统计学意义(t＝－7.167，P<0.001)。4EBP1基因敲除、敲除后分别转染4EBP1、plv-neo-4EBP1-37/46和plv-neo-4EBP1-4A的4种ZR-75-1细胞中测得的R/F比值分别为5.48±0.33、3.83±0.10、3.53±0.23和1.87±0.05，组间比较差异有统计学意义(F＝151.995，P<0.001)；4种MCF-7细胞中测得的R/F比值分别为2.03±0.200、1.37±0.14、1.90±0.19和1.20±0.17，组间比较差异有统计学意义(F＝5.744，P＝0.001)。结论:4EBP1基因敲除乳腺癌细胞系可用于后续不同4EBP1磷酸化突变体对翻译起始作用的进一步研究。