酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

Development of real-time fluorescent enzymatic recombinase amplification method for severe fever with thrombocytopenia syndrome virus detection

二维码有效期 120s

摘要目的建立一种可用于检测发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)方法.方法以SFTSV非结构蛋白NSs基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合.利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的阳性对照品进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;接着以新型布尼亚病毒、新型冠状病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性;最后用26例临床样本,检测与RT-qPCR的一致性.结果在42℃恒温条件下,对于SFTSV RNA,40 min内最低检出限可达100 copies/p.l.当SFTSV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性;对26例怀疑为发热伴血小板减少综合征患者样本的检测显示,RT-ERA检测的敏感性和特异性分别约为88.9％和100.0％;kappa值为92.3％.结论建立了一种酶促重组等温扩增实时荧光技术的SFTSV核酸检测方法,具有简单快速、敏感特异等优点.该方法在SFTS病原监测上有一定的应用前景.