换一批基于ERA-CRISPR/Cas12a的肺炎克雷伯菌检测方法的建立
Establishment of a detection method for Klebsiella pneumoniae based on ERA-CRISPR/Cas12a
摘要目的 建立一种基于酶促重组等温扩增-成簇规律间隔短回文重复序列Cas12a蛋白(ERA-CRISPR/Cas12a)的肺炎克雷伯菌(KP)核酸检测方法.方法 针对KP(fimI)基因设计3条CRISPR RNA(crRNA),以含该基因的质粒为模板进行ERA扩增,通过CRISPR/Cas12a荧光反应筛选出最佳的crRNA.设计3对靶序列的ERA引物并构建9组引物组合,从中筛选出一组作为ERA-CRISPR/Cas12a反应的最佳引物,结合消线法核酸检测试纸技术(ERASE)建立完整检测体系.以十倍梯度稀释的fimI基因质粒为模板检测方法灵敏度;同时对KP和其他4种临床常见革兰阴性杆菌进行检测评价其特异性;检测34株临床分离株核酸,并与荧光定量PCR(qPCR)结果对比.结果 成功建立ERA-CRISPR/Cas12a检测体系,灵敏度试验中,质粒模板的荧光检测最低检出限(LOD)为1 copy/μl,ERASE试纸为10 copies/μl,均优于qPCR(100 copies/μl);特异性试验中,仅KP检测结果呈阳性;34株临床分离株中30株KP均被检出,与qPCR结果一致.结论 本研究成功建立了一种简便、经济且兼具高灵敏度与高特异性的KP核酸检测方法,该方法适用于经济欠发达地区的基层卫生机构开展核酸检测工作.
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关键词
成簇规律间隔短回文重复序列等温扩增肺炎克雷伯菌核酸检测消线法核酸检测试纸Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsIsothermal amplificationKlebsiella pneumoniaeNucleic acid testEasy-readout and sensitive enhanced strip
分类号
R446.5（诊断学）
栏目名称
DOI
10.11816/cn.ni.2026-252563
发布时间
2026-04-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家重点研发计划（2023YFC2605101）
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