换一批ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究
Construction of adeno-associated virus vector containing ANG-1 gene and its expression in pig mesenchymal stem cells
摘要目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础.方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用SalⅠ和BglⅡ双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中.用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定.分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究.结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致.重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统.293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1.1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光.结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础.
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关键词
血管生成素1/代谢腺病毒科/遗传学骨髓祖代细胞/代谢重组,遗传转染腺相关病毒载体骨髓干细胞Angiopoietin-1/metabAdenoviridae/genetMyeloid progenitor cells/metabRecombination,geneticTransfectionrAAVMesenchymal stem cells
分类号
R654.2（外科学各论）
栏目名称
DOI
10.3785/j.issn.1008-9292.2009.04.008
发布时间
2009-09-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
中国博士后科学基金（2002032188）
浙江省卫生厅重点资助项目（2005ZD012）
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