换一批
换一批利用CRISPR/Cas9系统制备斑马鱼cbsb敲除模型
Establishment of zebrafish cbsb-knockout model by gene editing with CRISPR/Cas9 system
摘要目的 采用成簇的规律性间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统对斑马鱼胱硫醚-β-合成酶b基因(cbsb)进行编辑,并制备稳定的斑马鱼cbsb敲除品系.方法 使用ClustaIX软件分析斑马鱼cbsb编码蛋白(Cbsb)的保守结构域,利用生物信息学选取向导RNA(gRNA)靶点,体外合成并纯化gRNA和密码子优化的Cas9 mRNA,在刚受精的斑马鱼胚胎(1-cell期)中显微注射混合的gRNA和Cas9mRNA,提取受精后3 d的斑马鱼幼鱼基因组,通过PCR扩增并测序分析靶点的切割效率,通过基因组扩增和测序筛选并获得cbsb敲除的稳定品系.结果 斑马鱼Cbsb与人、小鼠胱硫醚-β-合成酶(CBS)高度同源.在斑马鱼Cbsb保守结构域的编码序列处设计4个靶点,其中4#靶点具有高效的切割效率,利用该靶点制备并筛选获得多个cbsb敲除斑马鱼,选取-3+13 bps和-228 bps移码突变的两种品系,进一步筛选获得稳定的cbsb敲除品系.结论 利用CRISPR/Cas9系统成功制备了两种斑马鱼cbsb敲除的稳定品系,为进一步在斑马鱼活体中研究Cbsb的功能奠定了基础.
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关键词
胱硫醚-β-合成酶b硫化氢基因敲除斑马鱼成簇的规律性间隔的短回文重复序列/Cas9Cystathionine beta-synthase bHydrogen sulfideGene knockoutZebrafishClustered regularly inter-spersed short palindromic repeats(CRISPR)/Cas9
栏目名称
DOI
10.12056/j.issn.1006-2785.2024.46.4.2023-2213
发布时间
2024-04-03
基金项目
浙江省医药卫生科技计划项目（2022RC293）
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