LRIG1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选

Construction of LRIG1 Specific RNAi Expressing Vector and Screening of Stably Transfected Cell Clone

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摘要目的构建针对LRIG1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1)基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响,为探讨LRIG1基因沉默对人脑胶质瘤细胞的生物学行为调控奠定基础.方法根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1、LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA.合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列.用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15的筛选浓度.将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株.Western印迹法在蛋白水平上检测LRIG1的表达.结果重组pGenesil2-LRIG1-shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对GL15细胞的筛选浓度为600mg/L,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil2-LRIG1-shRNA1组细胞LRIG1蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative shRNA组.结论成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体(pGenesil2-LRIG1-shRNA1),转染细胞后可抑制LRIG1基因表达,为下一步研究其功能奠定基础.