'夏黑'葡萄组织培养、原生质体分离和瞬时表达体系的建立

Establishment of tissue culture,protoplast isolation and transient expression system in 'Summer Black'grape

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摘要本研究以'夏黑'葡萄(Vitis vinifera)为实验材料,通过调节不同植物生长调节剂浓度配比,探究'夏黑'葡萄愈伤组织诱导及生根诱导的最适培养基,并在最适培养基条件下,以无菌苗叶片和绿色、黄绿色愈伤组织为材料,对原生质体提取及转化条件进行优化.结果表明,最适合茎段诱导芽的培养基为MS+1.0 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.02 mg·L-1 α-萘乙酸(NAA),最适合茎段愈伤诱导的培养基为MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA,最适合叶柄愈伤诱导的培养基为MS+2.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA,最适合叶片诱导的培养基为MS+2.0 mg·L-1噻苯隆(TDZ)+1.0 mg·L-12,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.2 mg·L-1吲哚丁酸(IBA),最适合夏黑葡萄生根诱导的培养基为1/2MS+0.5 mg·L-1 IBA.以葡萄无菌苗叶片为最佳原生质体提取材料,在纤维素浓度为30 g·L-1、离析酶浓度为5 g·L-1、果胶酶浓度为4 g·L-1、甘露醇浓度为0.6 mol·L-1时,28℃黑暗条件下酶解6h,抽真空处理50 min后分离的原生质体最为理想.将能表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒pCAMBIA1302利用聚乙二醇4000 (PEG4000)介导法转化原生质体后,观察到强烈的绿色荧光信号,表明分离的葡萄原生质体可以用作基因瞬时表达体系;并且当PEG4000浓度为300 g·L-1时,转化效果最佳.利用CRISPR-pr具在葡萄VvZEP基因的第一个外显子中设计了2个sgRNA,通过酶切、PCR重组构建了含有2个靶标位点的靶向于VvZEP基因的CRISPR/Cas9载体pGREBn-VvZEP,为后续基因编辑载体转入葡萄原生质体提供了基础.