番茄叶绿体外膜转运蛋白SlToc159-2的多克隆抗体制备以及果实中蛋白表达分析

Polyclonal antibody preparation and protein expression analysis of tomato chloroplast outer membrane transporter SlToc159-2 in fruit

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摘要核编码叶绿体蛋白通过叶绿体被膜上的TOC-TIC装置靶向导入叶绿体,对于叶绿体生物发生以及植物生长发育至关重要.Toc159家族蛋白是前体蛋白导入叶绿体这一过程中最重要的受体.以前期克隆到的番茄SlToc159-2基因为模版,选取SlToc159-2基因N端409～745个氨基酸之间包括5个保守GTPase基序的cDNA序列,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,融合N端GST标签,并转化大肠杆菌BL21(DE3),探索不同诱导条件下目的蛋白表达.GST-SlToc159-2409-745重组蛋白在1 mmol·L-1 IPTG,16℃ 4 h诱导表达效果最好,融合蛋白主要以包涵体形式存在.融合蛋白经过亲合纯化,凝胶过滤层析纯化,离子柱纯化后作为抗原,进行3次免疫注射兔子,1周后采心脏血作为多克隆抗血清,通过抗原亲和纯化,得到多克隆抗体anti-SlToc159-2409-745,将纯化后的抗体通过间接酶联免疫(ELISA)和蛋白质印迹(Western blot)分析,表明所制备的抗体具有很好的效价,效价比为1∶128 000,同时具有良好的灵敏度和特异性.通过免疫印迹检测SlToc159-2在番茄不同成熟度果实中的表达情况,结果显示,SlToc159-2在绿熟期表达量较低,在果实成熟过程中表达量升高.SlToc159-2抗体的成功制备为深入探究番茄中复杂的叶绿体蛋白导入机制奠定了基础.