摘要目的 建立C17.2 细胞膜固相色谱法联合超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS/MS)筛选补阳还五汤的活性成分,并探讨潜在活性成分促进缺血性脑卒中后神经干细胞增殖、分化的作用及其机制.方法 采用细胞膜固相色谱法与UPLC-Q-TOF-MS/MS富集筛选补阳还五汤与神经干细胞特异性结合的活性成分,并通过对照品进行定性,确定补阳还五汤与小鼠神经干细胞的特异性结合成分.构建C17.2 细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,并将其分为正常组、模型组以及高剂量和低剂量毛蕊异黄酮组.通过 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫荧光试验评估神经干细胞的增殖情况.同时,利用免疫荧光染色观察胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异核蛋白(NeuN)的表达,以评估神经干细胞的分化水平.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组细胞培养上清中白细胞介素 6(IL-6)的分泌水平,蛋白免疫印迹法检测巢蛋白(Nestin)、GFAP、NeuN、Janus激酶 2(JAK2)、磷酸化JAK2(p-JAK2)、信号转导和转录激活因子 3(STAT3)及磷酸化STAT3(p-STAT3)的表达.结果 根据C17.2 细胞膜固相色谱法联用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析结果,成功分离出四种与神经干细胞特异性结合的成分,分别为毛蕊异黄酮(C16 H12 O5)、芒柄花素(C16H12 O4)、芒柄花苷(C22 H22 O9)和没食子酰芍药苷(C30 H32 O15).免疫荧光结果显示,与正常组比较,模型组的BrdU阳性细胞明显减少(P＜0.01),GFAP、NeuN的表达增加(P＜0.01,P＜0.05);与模型组比较,毛蕊异黄酮能明显提升神经干细胞中BrdU(P＜0.01)和NeuN(P＜0.01,P＜0.05)的表达,同时降低GFAP(P＜0.01)的表达.ELISA结果表明,与正常组比较,模型组的细胞上清中IL-6 含量明显升高(P＜0.01);与模型组比较,毛蕊异黄酮明显降低了 IL-6 的释放(P＜0.01).蛋白免疫印迹分析结果显示,与正常组比较,模型组的 NeuN、GFAP蛋白及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 比值明显升高(P＜0.01);与模型组比较,低、高剂量毛蕊异黄酮组能够抑制OGD/R神经干细胞中GFAP蛋白的表达(P＜0.01),并降低p-JAK2/JAK2(P＜0.01)和p-STAT3/STAT3(P＜0.05)比值,其中低剂量毛蕊异黄酮能够增加OGD/R神经干细胞中NeuN的表达(P＜0.05),高剂量的毛蕊异黄酮处理还能够明显增加OGD/R神经干细胞中Nestin表达(P＜0.01).结论 通过C17.2 细胞膜固相色谱法与液质联用技术,鉴定出毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷、没食子酰芍药苷 4 个神经干细胞特异性结合成分.其中毛蕊异黄酮可能是补阳还五汤在促进缺血性脑卒中后神经再生及改善神经功能中的关键成分,能够促进氧糖剥夺再灌注后神经干细胞的增殖和诱导其向神经元的分化,并抑制星形胶质细胞的表达,其机制可能与JAK2/STAT3 信号通路相关.