CYP2C9基因沉默细胞株构建及其对三氯乙烯毒性的影响

Construction of CYP2C9-silent hepatocytes and effects of CYP2C9-silence on trichloroethylene toxicity

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摘要目的建立细胞色素氧化酶P450 2C9(CYP2C9)基因沉默正常肝细胞株(L02)并观察其对三氯乙烯(TCE)毒性的影响.方法设计合成短发卡RNA(shRNA)将其连接到PLVX-shRNA2P质粒中构建CYP2C9 shRNA慢病毒表达载体,感染L02细胞.采用荧光定量PCR和western blot筛选鉴定CYP2C9沉默细胞株.分别采用浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mmol/L的TCE染毒剂量组对L02细胞和CYP2C9基因沉默细胞株染毒24 h,同时设置二甲基亚砜溶剂对照组即0 mmol/L染毒剂量组,观察L02细胞和CYP2C9基因沉默细胞株细胞周期的变化以及凋亡基因Bcl-2和caspase-3表达变化.结果酶切和测序结果证明插入PLVX-shRNA2P载体的CYP2C9基因干扰序列与设计的shRNA序列一致.CYP2C9沉默细胞株的CYP2C9 mRNA和蛋白相对表达水平分别较shRNAc沉默对照细胞下降76.0％和78.6％.TCE染毒后,0.5、2.0、8.0 mmol/L3个染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞和L02细胞周期没有发生显著变化.TCE染毒后,2.0和8.0 mmo]/L染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞的Bcl-2表达水平均高于相应染毒剂量组L02细胞,而0.5、2.0、8.0 mmol/L 3个染毒剂量组CYP2C9基因沉默细胞的caspase-3表达水平没有显著变化.结论三氯乙烯对正常肝细胞和CYP2C9基因沉默细胞凋亡基因Bcl-2存在差异,提示CYP2C9与三氯乙烯在生物体内毒性存在一定关系.