siRNA干扰HepG2.2.15细胞BUBR1基因及对细胞增殖的影响

siRNA interference of BubR1 gene in HepG2 . 2 . 15 cells and its effect on cell proliferation

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摘要目的利用慢病毒载体和RNAi干扰技术沉默稳定转染了HBV全基因组的肝癌细胞HepG2.2.15的BUBR1基因,并检测沉默后对细胞增殖的影响.方法设计BUBR1基因的小干扰RNA,构建稳定遗传的慢病毒载体质粒,并进行测序鉴定.测序正确后用293T细胞进行包装并获得具有高感染性的BUBR1 shRNA重组慢病毒,用重组慢病毒感染HepG2.2.15细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况;Real-time PCR检测沉默效果;MTT法检测沉默BUBR1后对HepG2.2.15细胞增殖的影响.结果测序结果证明干扰载体中的特异性干扰序列完全正确,测序鉴定正确的BUBR1 shR-NA重组慢病毒转染293T细胞48 h,荧光显微镜下可见绿色荧光,病毒滴度约为10-9 TU/mL;制备成功的重组慢病毒BUBR1 shRNA以MOI=10感染HepG2.2.15细胞,72 h后转染率均达80％以上,用嘌呤霉素筛选得到稳转细胞株;Real-time PCR检测显示3对shRNA靶点转染HepG2.2.15细胞后,均显著下调BUBR1 mRNA的转录水平;MTT结果显示沉默BUBR1对HepG2.2.15细胞增殖没有明显影响.结论成功构建BUBR1基因慢病毒干扰载体,该病毒载体能有效沉默HepG2.2.15细胞的BUBR1基因,沉默后不影响HepG2.2.15细胞的增殖.