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摘要阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床上的主要病理特征是β淀粉样蛋白在细胞外沉积形成老年斑和tau蛋白过度磷酸化在细胞内形成神经纤维缠结，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍等。针对AD的发病机制，已经研究了很多对其治疗的药物，但是由于其病因的复杂性，目前仍然没有有效的方法逆转和阻止病情进展，我们利用结构生物信息学工具设计了一种药物，希望可以有效地防治AD的发生。<br>　　研究目的：<br>　　N-[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl]-3-phenyl-acrylamide(gx-50)是存在于花椒中的一种天然化合物，根据生物信息学的理论可以推断出gx-50可以对AD有一定的治疗作用。为了验证这一理论，我们设计了一系列与药物研究相关的体内体外生物学实验，根据所获得的实验数据来判断gx-50是否可以有效地、安全地防治AD；除此之外，在验证gx-50对AD的发生有一定疗效之后，我们进一步设计生物学实验来初步探索gx-50在干预AD过程中所涉及到的细胞分子机制。<br>　　研究方法：<br>　　对大鼠口服gx-50(20mg/kg)后，在不同时间点收集大鼠的各个组织器官，采用代谢动力学方法研究gx-50在机体内各组织的代谢情况；之后对东莨菪碱痴呆小鼠模型和转基因痴呆小鼠腹腔注射gx-50(1mg/kg)，采用Morris水迷宫动物行为学实验验证gx-50改善痴呆小鼠记忆力的能力；在完成水迷宫实验之后，将转基因小鼠灌流取出大脑组织，采用UPLC/Q-TOF-MS方法检测gx-50在转基因小鼠大脑中的蓄积情况。<br>　　针对AD的病理特征之一淀粉样蛋白斑块进行实验。对完成Morris水迷宫实验的转基因小鼠大脑皮层中淀粉样蛋白斑块进行免疫组化分析，证明gx-50对斑块沉积的影响；另一方面，利用原子力显微镜观察gx-50和淀粉样蛋白寡聚体在37℃共孵育48h之后，淀粉样蛋白聚集体的空间结构变化，以此推断gx-50是否可以直接与淀粉样蛋白寡聚体相互作用。<br>　　将体外培养的神经元用Fluo-4钙染料共染后，利用激光共聚焦扫描显微镜观察gx-50和淀粉样蛋白对胞内Ca2+水平的影响；另一方面，将体外培养的神经元用gx-50(1μM)和Aβ25(25μM)处理24h，用TRIzol将其收集起来，进行基因芯片分析，筛选出351个与AD密切相关并在芯片数据中表现出显著性差异的基因，用Genespring软件、Blast2GO软件对这些基因数据进行统计归类，探索gx-50干扰 AD发生过程中所涉及到的分子以及信号通路。<br>　　筛选出Akt1、Apoe、App、Bdnf、Creb、Gsk3b、Ncstn和Psen18个与AD发生密切相关的基因，设计引物进行实时定量PCR分析，并且借此验证基因芯片数据的有效性；为了探索gx-50防治 AD过程中所涉及到的分子机制，从体外培养的神经元和Morris水迷宫实验中的转基型和野生型小鼠的大脑组织中提取蛋白，利用Western blot分析与突触的可塑性和记忆形成相关的AKT、GSK和CREB及其磷酸化蛋白在各处理组的表达变化；对Morris水迷宫实验中的转基型和野生型小鼠的大脑组织进行免疫组化分析，比较各组间磷酸化CREB的表达含量，以此推断gx-50对痴呆小鼠认知功能的影响。<br>　　研究结果：<br>　　通过代谢动力学实验发现gx-50被口服之后5min内即可被迅速吸收而后穿透血脑屏障进入大脑组织，同时在口服4h之后gx-50被肝脏代谢，被肾脏排除体外不会对机体造成副作用；Morris水迷宫实验中，东莨菪碱痴呆小鼠和APP转基因痴呆小鼠找到平台的潜伏期分别在70s、100s，随着训练次数的增加，潜伏期没有很大程度的缩减，而 gx-50处理组小鼠随着训练次数的增加潜伏期越来越短，最后分别在32s、75s左右即可找到平台，与此同时，gx-50提高了痴呆小鼠穿越平台的次数，平均可达2.4次、3次，这一实验结果表明gx-50有助于东莨菪碱造成的痴呆小鼠和APP转基因痴呆小鼠的认知障碍的改善；并且UPLC/Q-TOF-MS分析结果表明gx-50即使在体内的代谢速率很快并在短期内大部分gx-50被机体排除体外，但是仍然有相当一部分的gx-50可以蓄积在小鼠的大脑中持续发挥其药用作用。<br>　　对转基因小鼠大脑中的淀粉样蛋白斑块沉积情况进行免疫组化分析，实验结果显示生理盐水处理组的小鼠大脑皮层中有大量的淀粉样斑块沉积，而腹腔注射gx-50之后，将近60％的淀粉样斑块的形成被抑制，在大脑皮层中只发现零星的Aβ信号，证实了gx-50可以有效地干预AD的发生；而原子力显微镜观察结果显示gx-50和Aβ蛋白寡聚体共孵育之后，可以促进淀粉样蛋白寡聚体由团状的结构转变成分散的纤维状结构，表明gx-50可促使Aβ蛋白寡聚体发生解聚反应，减轻淀粉样蛋白的神经毒性作用。<br>　　激光共聚焦显微镜记录Ca2+荧光强度的变化说明淀粉样蛋白可以导致胞内钙超载，而提前10min用gx-50(5μM)预处理神经元后，胞内Ca2+的浓度降低了63%，有效地抑制Ca2+水平失常状况，gx-50通过稳定细胞内环境来保护神经元；另一方面，利用基因芯片技术分析351个表达变化具有显著性差异的基因，结果证实gx-50可以通过调节多种与AD相关的基因，分子信号通路，例如神经递质传递、信号转导、神经系统发育发生、蛋白磷酸化、基因转录和神经细胞凋亡死亡等来预防淀粉样蛋白对神经元造成损伤。<br>　　对gx-50/Aβ处理的神经元和脑组织进行实时定量PCR，结果显示筛选的8个与AD发生密切相关的基因在各组中的表达变化明显，并且与基因芯片的变化趋势一致，这表明gx-50可以通过影响这些与AD发生相关的基因的表达来干预AD的发生，同时也验证了芯片数据的可靠性；Western blot实验结果显示，相比于空白对照组无论是在Aβ处理的神经元还是在转基因痴呆小鼠的脑组织中，AKT、GSK、CREB三种蛋白磷酸化的表达量都降低，在体外，p-AKT、p-GSK、p-CREB三种蛋白的表达量分别降低到31%、44%和28%，在体内这三种蛋白表达量降低至57%、40%和22%，而gx-50处理之后在神经元和脑组织中磷酸化的AKT表达量分别提高到71%、79%，p-GSK的表达量分别提升到59%、73%，而p-CREB的表达量分别提高到70%、62%；而对转基因小鼠的大脑组织进行的免疫组化分析结果显示相比于未经gx-50处理组，腹腔注射gx-50的转基因小鼠的大脑皮层和海马区中磷酸化CREB的表达量分别上升86%、28%，这一结果证实gx-50通过GSK-3/CREB这一信号通路来改善转基因小鼠的痴呆状态，即它可以促进AKT蛋白的磷酸化，使 GSK蛋白失活，从而提高CREB蛋白磷酸化，由于CREB与学习记忆密切相关，所以提高CREB的活性，最终会促进认知能力的提高。<br>　　综上所述，我们的研究结果证明花椒中的天然化合物gx-50可以穿透血脑屏障进入大脑组织，通过调节一些细胞分子信号通路，减少淀粉样蛋白在大脑皮层的沉积，降低淀粉样斑块对神经元造成的毒性作用，从而改善痴呆小鼠的认知能力，对防治AD而言gx-50是一种有效的、安全的化合物。