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摘要背景：胃癌是我国死亡率第三位的恶性肿瘤。传统分期手术辅助放化疗治疗方法疗效不肯定，且常伴随严重的毒副作用。因此探索高效低毒的治疗方法有极其重要的意义。细小病毒是具有选择性杀伤肿瘤作用的溶瘤病毒，其非结构蛋白（nonstructural protein1，NS1）具有独立的抑瘤作用，既往研究报道 NS1蛋白对包括胃癌在内的多种消化道肿瘤具有确定的抑制作用。本研究将在前期研究的基础上进一步探讨NS1在体内体外的抑瘤作用及效应机制，特别是体内转染系统性表达NS1蛋白的抑瘤作用及安全性。<br>　　第一部分 eGFP-NS1重组基因真核表达载体的构建及体外瞬时转染<br>　　目的：构建带有绿色荧光蛋白标签的细小病毒非结构蛋白NS1基因的真核表达质粒，脂质体介导质粒瞬时转染使胃癌细胞表达融合蛋白。<br>　　方法：以前期研究中构造的pcDNA3.1(+)-NS1重组质粒为模板，设计特异性引物扩增NS1基因片段全长，经琼脂糖电泳分离酶切产物，回收目的片段，使用XhoI、BamHI双酶切后插入pEGFP-C1载体中，所得产物转化大肠杆菌后进行抗性筛选，挑取所得菌落进行测序，携带完整NS1的质粒被用于进一步实验。使用脂质体介导质粒转染胃癌细胞，设置空质粒转染组为阴性对照，磷酸盐缓冲液处理组为空白对照，检测各组目的基因的表达及荧光信号表达。<br>　　结果：酶切及测序结果显示NS1基因已完整连接至pEGFP-C1载体中，转染后细胞表达NS1基因，胞内可检测到绿色荧光蛋白信号，转染效率达80％。与阴性对照组相比，实验组荧光信号集中于胞核内。<br>　　结论：成功构建带有绿色荧光蛋白标签的NS1融合基因的真核表达质粒，脂质体介导质粒瞬时转染可使胃癌细胞表达目标融合蛋白。<br>　　第二部分 NS1蛋白在体外对胃癌细胞的抑制作用及作用机制研究<br>　　目的：体外验证NS1蛋白对两种胃癌细胞的抑制作用，探索其抑瘤效应机制。<br>　　方法：介导重组质粒转染胃癌细胞，同时设置空载体转染组为阴性对照，磷酸盐缓冲液处理组为空白对照，绘制各组的细胞生长曲线，根据生长曲线计算间隔24小时的抑制率。检测实验组及阴性对照组转染后不同时间点胞内活性氧基，通过检测细胞衰老β半乳糖苷酶水平研究细胞衰老状态，分析各组转染后不同时间点细胞周期分布，鉴定周期调控关键因子蛋白含量及mRNA表达水平变化。<br>　　结果：与阴性对照及空白对照组相比，实验组细胞生长明显受抑制，转染后1-4天SGC7901及MGC80-3细胞的抑制率分别为45%、62%、73%、77%及73%、88%、93%、95%。表达EGFP-NS1融合蛋白的细胞周期停留于G0/G1期，胞内p21蛋白在转染6-8小时后显著升高，但mRNA水平无明显改变。转染24小时后实验组老化细胞增多（实验组(31.1±2.7)%VS阴性对照组(3.5±3.5)%，p=1.92*10-5），但胞内活性氧基水平与对照组相比并无显著差异。<br>　　结论：NS1蛋白可显著抑制胃癌细胞生长，其机制或在于诱导胞内p21蛋白蓄积并阻滞细胞周期于G0/G1期。<br>　　第三部分裸鼠体内转染eGFP-NS1融合基因对胃癌移植瘤的抑制作用及安全性的研究<br>　　目的明确体内转染 EGFP-NS1融合基因对胃癌移植瘤的抑制作用及对重要脏器的影响。<br>　　方法使用2*107 SGC7901细胞皮下注射成瘤，待瘤体生长至0.5*0.5cm大小时，使用多聚乙酰亚胺介导重组质粒（实验组）或空载体（阴性对照组）活体瘤内转染，每3天处理一次，共转染6次，空白对照组于等时间间隔予等体积生理盐水瘤内注射。使用荧光照相机检测荧光蛋白在小鼠体内的表达，比较各组胃癌移植瘤生长状况，观察转染期间小鼠毒副反应。第6次转染后处死小鼠，留取瘤体及肺组织标本，测量瘤体直径，对标本进行免疫组织化学及病理学检查，检测NS1蛋白的表达及其对癌瘤组织及正常组织的影响。<br>　　结果空白对照组，阴性对照组，实验组肿瘤体积分别为(1.98±0.60)cm3、(2.00±0.47)cm3、(0.30±0.12)cm3，实验组与空白对照组及阴性对照组相比，瘤体大小差异具显著统计学意义（p<0.05）。实验期间小鼠未出现明显毒副反应。转染后NS1蛋白蓄积于肺、脑等血供丰富组织，肺组织病理学未示明显异常。<br>　　结论绿色荧光蛋白标记的NS1可直观地展示目的蛋白在体外及体内的表达代谢过程。体内转染NS1基因可有效抑制胃癌移植瘤生长，且对重要器官无明显不良影响。NS1有望成为消化道肿瘤基因治疗的新工具。