检索历史 清除

摘要目的：<br>　　肠道病毒71型(EV71)属微小RNA病毒科肠道病毒属A组,是引起手足口病的主要病原体之一。MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的单链非编码小分子 RNA，miRNA不编码蛋白,而是通过与mRNA的3'端非编码区或编码区的结合位点结合，降解或者抑制mRNA的翻译来抑制基因的表达。在EV71感染神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）miRNA差异表达谱的实验基础上，利用miRNA（模拟体）mimic和 miRNA（抑制体）inhibitor筛选并验证了对EV71有调控作用的miRNA-155(miR-155)，并进一步阐明了miR-155通过靶向PICALM抑制EV71在神经细胞中的复制。<br>　　方法：<br>　　（1）收集感染EV71前后的SK-N-SH神经细胞，提取总RNA，利用miRNA芯片得出EV71感染SK-N-SH前后差异miRNA表达谱，筛选EV71感染SK-N-SH前后显著差异的miRNA；并利用实时荧光定量RT-PCR(QRT-PCR)验证芯片结果。<br>　　（2）利用miRNA mimic和 miRNA inhibitor转染SK-N-SH神经细胞，改变miRNA水平，利用细胞病变效应（CPE）观察、病毒滴度TCID50测定、QRT-PCR、Western blotting(WB)等方法,与阴性对照组和空白对照组比较EV71病毒复制的变化，验证miRNA对EV71在SK-N-SH神经细胞中复制的调控作用。<br>　　（3）利用miRNA的靶基因数据库miRanda,TargetScan和miRbase，筛选miRNA的靶基因，双荧光素报告酶法验证miRNA的靶基因。利用靶基因的过表达载体和小干扰RNA(si-RNA)分别上调和下调靶基因的表达后，观察miRNA对EV71调控作用的变化，验证miRNA通过靶向基因调控EV71在神经细胞中的复制。<br>　　结果:<br>　　（1）在EV71感染SK-N-SH神经细胞后，miRNA芯片和qRT-PCR结果均显示miRNA-155的表达水平显著上升，且miR-155的上升与EV71病毒的感染量、感染时间均呈正相关。<br>　　（2）miRNA-155 mimic转染SK-N-SH神经细胞后，miR-155水平显著上升，与阴性对照相比，EV71在SK-N-SH神经细胞中的复制被抑制。同时，miR-155对EV71病毒复制的抑制作用与miR-155的表达水平呈正相关。<br>　　（3）利用miRBase等生物学软件并结合基因功能，筛选出miR-155的候选靶基因PICALM。在EV71病毒感染SK-N-SH神经细胞后，PICALM基因的蛋白水平明显下降。利用PICALM的过表达载体和siRNA分别上调和下调该基因表达，结果显示，过表达PICALM基因能够减少miR-155对EV71的抑制作用，而下调PICALM基因的表达能够进一步抑制EV71的复制。<br>　　结论：<br>　　本研究发现miR-155通过靶向PICALM抑制EV71在SK-N-SH神经细胞中的复制。