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白血病恶性表型与糖基化相关性探索研究

摘要目的:目前在白血病分子机制的研究中,疾病相关蛋白的翻译后加工主要集中于磷酸化和乙酰化修饰,而对蛋白质翻译后加工的最主要方式——糖基化却甚少涉及。本研究旨在探索白血病恶性表型与糖基化的相关性。<br>  方法:(1)TCGA数据库收集得到183例急性白血病病例,大数据处理方法探讨研究多肽:N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(Polypepide: N-Acetylgalactosaminyltransferases,pp-GalNAc-Ts,EC.2.1.41)家族pp-GalNAc-T1、T2及 N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶β3GnTs家族特别是β3GnT8与白血病细胞相关性。采用Affymetrix GeneChip Command Console软件(version4.0,Affymetrix)处理提取原始数据。利用Genespring软件(version12.5; Agilent Technologies)进行RNA标准化和后续处理。差异基因利用T检验的p值和倍数变化值进行筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值>=2.0且P值<=0.05。对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能或者通路。对差异基因进行非监督层次聚类,展示差异基因在不同样本间的表达模式。(2)运用实时定量PCR、Western Blot、Lectin Blot、流式细胞术等方法,检测白血病细胞K562和HL60,mRNA水平、蛋白水平糖基化相关糖基转移酶表达变化,并检测细胞表面 N-聚糖、O-聚糖等糖链结构,与白血病临床分型及白血病细胞的恶性表型的关系作较深入的研究。(3)收集白血病临床病例骨髓涂片130例,通过凝集素免疫组化方法,观察在白血病急慢性的不同分型、患者不同年龄、患者性别等分组中,β3GnT8(GalT7)和β3GnT2傕化产物多聚乳糖胺链的表达差异,并进行统计分析。<br>  结果:(1)183例急性白血病病例样本数据的箱线图、矩阵图显示,实验样本数据均一性好,不同组别两组间数据总体分布集中趋势,同组的样品在主成分分析图空间分布比较集中。通过火山图筛选得到染色体核型异常组和基因突变组各组中有统计学意义的差异表达基因。GO分析和Pathway寻找与糖基化相关基因的表达变化。在15;17染色体核型异常组与 Normal-1染色体核型正常组相比,β3GnT8的表达有所下降,涉及的细胞组分包含:细胞膜、整合膜、高尔基体。MMP2、MMP14、c-jun等基因的表达都有一定程度的上升,这些基因共同参与MAPK通路。在pml-rar突变组与Normal-2未突变组相比,B3GalT1的表达下降,涉及的细胞组分为高尔基体。同时,随着β3GalT2和β3GnT5的表达都有所下降,GnT-V(也称为 MGAT5,导致 G1cNAcB1,6分支的酶)表达降低。此外,ppGalNAc-T2、ST3Gal4、ST3Gal6等基因的表达反而升高。(2)实时定量 PCR结果显示:K562细胞中β3GnT2、GNTⅤ的基因表达显著高于HL60,且两株细胞中β3GnT8与其他两个基因相比,表达较低。HL60中β3GnT8的基因表达低于K562。ppGalNAcT1、ppGalNAcT2是催化O-型多聚乳糖胺链合成的糖基转移酶基因,实时定量PCR结果显示K562细胞中ppGalNAcT1、ppGalNAcT2的基因表达均显著高于 HL60。ST6GalTs是催化α-2,6唾液酸链合成的酶,K562中ST6GalT1基因表达显著高于 HL60,ST6GalT4在两株细胞中表达差异不大。ST3GalT1是参与催化α-2,3唾液酸链合成的酶,HL60细胞中ST3GalT1基因表达显著高于K562。Western Blot结果显示K562中β3GnT8和ppGalNAcT2的蛋白表达均显著高于HL60。Lectin Blot实验用番茄凝集素特异性结合细胞中多聚乳糖胺链,检测结果显示 K562细胞中糖链表达高于 HL60。流式细胞术结果显示凝集素SNA特异性识别α-2,6连接的唾液酸,K562细胞表面的α-2,6连接的唾液酸表达显著低于HL60。凝集素MALⅡ特异性识别α-2,3连接的唾液酸,两株细胞表面的α-2,3连接的唾液酸表达差异不明显。(3)检测了β3GnT8(GalT7)和β3GnT2傕化产物多聚乳糖胺链在130例白血病骨髓涂片中的表达情况,发现慢性白血病中,多聚乳糖胺链均有中高为主表达,而急性白血病中,多聚乳糖胺链也有中低为主表达。证明在临床急慢性白血病骨髓样本中β3GnTs家族及催化产物多聚乳糖胺链均有表达增高,且以慢性更甚。

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