摘要目的:<br> 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)——SAHA是一类治疗血液恶性肿瘤的新型靶向抗肿瘤药物,但随着药物使用时间的延长及受试人群的增多,对 SAHA的耐药不可避免的出现了,多药耐药性目前仍然是临床上治疗恶性血液病的一大障碍。为了探究β3GnT8催化合成的多聚乳糖胺链与白血病细胞SAHA耐药性的相关性从而寻找到新的治疗靶点,本文通过筛选耐药细胞株K562/SAHA,检测多聚乳糖胺和β3GnT8在耐药株 K562/SAHA与 K562细胞中表达水平差异;并通过si-RNA干扰β3GnT8后,检测耐药细胞株中多聚乳糖胺链的表达情况、细胞凋亡和细胞周期的变化情况以及耐药细胞株的药物敏感性的变化,初步探讨多聚乳糖胺 N-聚糖与白血病细胞耐药性的关系。本文还研究了中药雷公藤甲素对乳腺癌耐药株MCF-7/Adr的侵袭迁移能力影响的作用机制。<br> 方法:<br> (1)抗肿瘤药物SAHA处理K562细胞后,通过Western blot检测糖基转移酶β3GnT8、β3GnT2以及糖蛋白 CD147在蛋白水平的表达变化;流式细胞术和Lectin blot分别检测K562细胞表面及细胞总的多聚乳糖胺链的表达变化。(2)MTT药物敏感性实验测得SAHA对K562细胞的半数致死率(IC50),利用逐步递增浓度间歇作用法筛选耐药细胞株K562/SAHA。(3)Real-time PCR检测K562和K562/SAHA中耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)、β3GnTs、ppGalNAcTs、MMPs和末端唾液酸等基因的mRNA水平表达差异;Western blot检测K562和K562/SAHA中肿瘤干细胞标志物CD133、β3GnT8和CD147蛋白表达差异;流式细胞术检测两株细胞的早期凋亡情况差异;流式细胞术和Lectin blot分别检测两株细胞的细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺的表达情况。(4)siRNA干扰K562/SAHA中β3GnT8后,通过流式细胞术和Lectin blot分别检测细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺的表达变化;流式细胞术检测K562/SAHA早期凋亡和周期的变化;MTT检测K562/SAHA药物敏感性变化。(5)用一定浓度梯度的中药雷公藤甲素处理乳腺癌耐阿霉素耐药细胞株 MCF-7/Adr,MTT检测 MCF-7/Adr对雷公藤甲素的药物敏感性;Hoechst33258凋亡小体染色法检测细胞凋亡情况;流式细胞术和Lectin blot分别检测细胞表面和细胞总的多聚乳糖胺链的表达变化;Real-time PCR和Western blot分别检测细胞中β3GnT8、β3GnT2、CD147和MMP14的mRNA和蛋白表达变化;Transwell检测耐药细胞株侵袭迁移能力的改变。<br> 结果:<br> (1)SAHA处理K562细胞后,β3GnT8、β3GnT2和CD147蛋白水平表达降低,细胞总的多聚乳糖胺链表达下降,且具有时间依赖性。(2)筛选获得耐药细胞株K562/SAHA,耐药指数RI为14.74,K562/SAHA中P-gp基因mRNA表达水平以及肿瘤干细胞标志物CD133蛋白水平均明显高于K562细胞,上述结果表明成功筛选出耐药细胞株。(3)β3GnT8的mRNA和蛋白在K562/SAHA细胞中的表达均显著高于K562细胞;流式细胞术和Lectin blot结果显示多聚乳糖胺链在K562/SAHA细胞中表达水平明显高于K562细胞;高糖基化CD147在耐药细胞株中的蛋白表达显著增高。(4)siRNA干扰K562/SAHA中β3GnT8基因后,细胞中多聚乳糖胺表达量降低;细胞早期凋亡率显著上升;细胞周期多停滞在G1/S期;耐药细胞株对 SAHA药物敏感性显著提高。(5)雷公藤甲素处理耐药细胞株MCF-7/Adr,随着药物浓度的增加,细胞凋亡率显著提升;细胞表面的多聚乳糖胺链表达下降;β3GnT8的基因和蛋白表达均下降,MMP14基因表达下降;耐药细胞株的侵袭迁移能力明显减弱。<br> 结论:<br> (1)耐药细胞株K562/SAHA高表达多聚乳糖胺和糖基转移酶β3GnT8,细胞对药物SAHA的敏感性显著降低;当干扰了K562/SAHA中的β3GnT8后,细胞中多聚乳糖胺表达下调,细胞凋亡率显著上升,细胞周期阻滞,且细胞药物敏感性显著升高。由此推测β3GnT8的高表达导致 K562细胞异常糖基化,进而形成K562/SAHA的耐药性;干扰耐药细胞株K562/SAHA中的β3GnT8可以逆转耐药性。(2)雷公藤甲素可能通过抑制β3GnT8等糖基转移酶基因的转录,阻止多聚乳糖胺的合成,从而影响CD147的糖基化修饰,进而导致CD147对MMPs的调节发生改变,最终减弱肿瘤细胞的侵袭迁移能力。
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