检索历史 清除

摘要目的：<br>　　鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是好发于我国南方及东南亚地区最为常见的恶性肿瘤之一，其年发病率在30~80/10万，尤其以广东为甚。临床上鼻咽癌以高转移、高复发和低分化为显著特征，将近88.0％的鼻咽癌患者初诊时已有颈部淋巴转移，颈淋巴结转移被视为鼻咽癌发病的显著特征之一。鼻咽癌发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，EB病毒感染及其他多种非病毒因素（如化学致促癌物）参与鼻咽癌发生、发展和转移。新近研究发现，醛酮还原酶家族1成员B10（AKR1B10，Aldo-keto reductase1B10）在鼻咽癌发生、发展和转移中起促进作用，但AKR1B10参与鼻咽癌转移的确切分子机理仍不清楚。<br>　　二亚硝基哌嗪（DNP，N。N'-Dinitrosopiperazine）是鼻咽癌非病毒因素（如化学致促癌物）的致病因子之一。前期研究发现，DNP通过活化多个信号分子，促进鼻咽癌细胞侵袭迁移，AKR1B10是其中的一个重要分子，推断DNP可以介导AKR1B10表达参与鼻咽癌转移。本文首先采用免疫组织化学和酶联免疫吸附的方法，分析了AKR1B10在鼻咽癌组织和血清中的表达情况，从组织和血清学的层面明确AKR1B10表达与鼻咽癌发生发展及转移的关系。然后，应用分子克隆技术、基因转染技术、基因干扰技术、Real-time PCR技术和Western Blotting技术等探讨DNP对鼻咽癌细胞AKR1B10表达的影响，明确DNP上调AKR1B10表达促进鼻咽癌细胞的侵袭转移。最后，从细胞生物学功能角度进行研究，采用克隆形成试验、Transwell迁移和侵袭试验等考察DNP通过介导AKR1B10表达对鼻咽癌细胞生物学功能和行为的影响，从而阐明DNP可以诱导AKR1B10表达参与鼻咽癌转移的分子机制，为探讨鼻咽癌高转移的分子机理以及鼻咽癌筛查诊断的血清标志物、转移的检测和靶向治疗候选分子的筛选提供有价值的参考和依据。<br>　　方法：<br>　　（1）免疫组化检测鼻咽癌患者原发部位和有淋巴转移组织中 AKR1B10蛋白表达水平，分析组织中的AKR1B10表达水平与鼻咽癌发生发展转移的关系。<br>　　（2）ELISA法检测鼻咽癌无转移和有转移患者血清中AKR1B10的表达水平，明确AKR1B10血清学水平与临床鼻咽癌转移的关系。<br>　　（3）用不同浓度DNP处理6-10B和5-8F细胞，MTT实验分析DNP对6-10B和5-8F细胞的非毒性浓度（NCC）和时效关系，确定DNP非毒性浓度。<br>　　（4）分析 DNP处理组和对照组细胞 AKR1B10蛋白质表达的差异，明确DNP诱导AKR1B10表达。<br>　　（5）应用分子克隆技术，构建AKR1B10过表达载体pcDNA3.1-AKR1B10，为后续研究做准备。<br>　　（6）将过表达载体pcDNA3.1-AKR1B10转染6-10B细胞，筛选稳定克隆株。1640培养基培养稳定细胞株，检测对照组和转染组之间AKR1B10蛋白质表达的差异，明确AKR1B10高表达对鼻咽癌细胞侵袭转移能力的影响。<br>　　（7）细胞克隆形成试验、Transwell迁移与侵袭实验分析DNP诱导AKR1B10表达对6-10B和5-8F细胞迁移和侵袭能力的影响，明确DNP是否促进鼻咽癌细胞的运动迁移和侵袭。<br>　　（8）采用siRNA干扰技术阻断6-10B和5-8F细胞AKR1B10的表达，分析DNP在 AKR1B10表达被干扰后对鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力的影响，明确DNP通过介导AKR1B10表达促进鼻咽癌细胞侵袭转移。<br>　　（9）实验结果和数据利用SPSS19.0软件进行统计分析，选用非参数检验。<br>　　结果：<br>　　（1）免疫组织化学技术检测了20例正常鼻咽黏膜上皮组织(NNET)、20例无淋巴结转移鼻咽癌组织（NPC，AJCC/UICC2009分期）、30例有淋巴结转移鼻咽癌组织（LMNPC）中AKR1B10表达。结果显示AKR1B10在NNET、NPC及LMNPC组织的阳性率分别为10.0%(2/20)、85.0%(17/20)、93.3%(28/30)；AKR1B10在鼻咽癌中的表达明显高于正常鼻咽组织（P<0.05），并且LMNPC组织中的表达高于无转移鼻咽癌组织，二者比较有差别意义（P<0.05），提示AKR1B10表达升高与鼻咽癌发生发展有关，其表达上调与临床鼻咽癌发展转移正相关。<br>　　（2）ELISA法检测鼻咽癌患者血清中 AKR1B10水平，考察并明确血清AKR1B10水平与鼻咽癌发生发展及转移的关系。第一部分检测了30例健康对照组、8例鼻咽炎症组、71例鼻咽癌组（不分期）血清中AKR1B10的表达情况，结果显示AKR1B10在健康对照组、鼻咽炎症组、鼻咽癌组中的中位数浓度分别为：62.73 ng/L、408.01 ng/L、603.52 ng/L。AKR1B10在鼻咽癌和鼻咽炎症患者血清中均有表达升高，并且鼻咽癌组明显高于健康对照组和鼻咽炎症组（P<0.05），提示AKR1B10血清水平与鼻咽癌发生发展呈正相关。第二部分检测了70例有明确临床分期（AJCC/UICC2009分期）鼻咽癌患者血清标本中AKR1B10，其中无转移鼻咽癌患者3例，淋巴结转移鼻咽癌患者59例、远处转移鼻咽癌患者8例。三组血清AKR1B10的中位数浓度分别为：287.16 ng/L、482.08 ng/L、5878.21 ng/L，三组之间存在显著差异（P＜0.05）。结果提示，远处转移鼻咽癌患者AKR1B10的表达明显高于无转移和仅淋巴转移的病例（P<0.05），淋巴结转移组高于非转移组（P<0.05），提示AKR1B10血清学水平与临床鼻咽癌转移正相关，可以作为预测鼻咽癌转移的血清学候选标志物。<br>　　（3）MTT实验结果表明。DNP在0~100.0μmol/L时，对6-10B细胞的生长没有明显影响（P>0.05）；在150.0μmol/L以上时，DNP对6-10B细胞生长增殖有明显的抑制作用，表现细胞毒性反应（P<0.05）。0~100μmol/L是DNP处理6-10B细胞的非毒性浓度，而 DNP对5-8F细胞的非毒性浓度则为0~150μmol/L，后续研究工作以100.0μmol/L作为DNP工作浓度。<br>　　（4）细胞克隆形成实验结果表明，DNP处理组和对照组之间AKR1B10蛋白质表达和克隆形成数均存在差异，DNP处理组AKR1B10蛋白质表达高于对照组，克隆形成数也是DNP处理组多于对照组。<br>　　（5）应用分子克隆技术成功构建了 AKR1B10过表达载体 pcDNA3.1(+)-AKR1B10。将表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10转染6-10B细胞，Western Blotting分析显示对照组和转染组之间AKR1B10蛋白质表达存在差异（P<0.05）。<br>　　（6）Western Blotting分析DNP处理鼻咽癌细胞后AKR1B10的表达变化，结果表明用不同浓度的DNP处理6-10B细胞。AKR1B10的表达显著增强（P<0.05），呈时间依赖性和剂量依赖性。<br>　　（7）克隆形成、Transwell迁移和侵袭实验分析 DNP对鼻咽癌细胞6-10B和5-8F迁移侵袭能力的影响。实验结果表明，DNP对6-10B细胞的运动迁移和侵袭能力起到明显增强作用；且阻断AKR1B10后，DNP诱导6-10B和5-8F细胞迁移侵袭的能力降低（P<0.05）。<br>　　（8）细胞免疫荧光结果显示：DNP介导6-10B细胞AKR1B10表达以及5-8F细胞AKR1B10表达，蛋白表达主要定位于细胞浆。<br>　　结论：<br>　　（1）鼻咽癌组织和血清AKR1B10检测表明，颈部淋巴结转移和远处转移鼻咽癌患者的AKR1B10表达水平明显高于鼻咽癌未转移组和正常对照组，提示AKR1B10表达上调与临床鼻咽癌的发生发展及转移有关，可以作为鼻咽癌进展和治疗预后判断的候选标志物。<br>　　（2）DNP通过介导AKR1B10高表达，增强鼻咽癌细胞侵袭和迁移能力。提示DNP作为化学致癌剂可能是鼻咽癌高转移重要的诱因之一。AKR1B10可能是鼻咽癌转移中一个重要的信号分子。<br>　　（3）通过克隆形成试验、Transwell迁移、侵袭实验等细胞功能实验考察了DNP介导AKR1B10表达对鼻咽癌细胞生物学特性的影响，从而阐明DNP可以通过介导AKR1B10表达参与鼻咽癌的侵袭转移。<br>　　（4）应用基因干扰技术、分子克隆技术、Real-time PCR技术以及Western Blotting等方法从基因和蛋白质水平研究并验证了阻断AKR1B10表达可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移，提示AKR1B10可以作为鼻咽癌转移治疗的靶分子。