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摘要气道重构是多种慢性肺气道疾病（如哮喘、慢性阻塞性肺炎）的主要病理特征，包括气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）、上皮细胞、腺体细胞、血管细胞和细胞外基质的改变。细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），也存在于烟雾、粉尘中，可诱导气道重构，但机制并不完全明了。乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）是气道中重要的副交感神经递质，除神经细胞外，ASMCs及气道上皮细胞等也可分泌ACh。大量文献表明除收缩作用外，ACh可能与气道炎性及气道重构有一定关系。经典瞬时受体电位通-3（canonical transient receptor potential channel-3，TRPC3）编码天然固有活性的非选择性阳离子通道（nonselective cation channels，NSCCs），通过介导胞内钙浓度的变化，在ASMCs的收缩及气道高反应性中发挥重要作用，但是其在气道重构中的作用尚不清楚。因此，本课题中，我们分别采用LPS及ACh作为工具药刺激原代小鼠ASMCs增殖，探讨TRPC3在ASMCs增殖中的作用，为探寻干预气道重构的靶点提供依据。<br>　　第一部分：TRPC3在LPS诱导气道平滑肌细胞增殖中的作用。<br>　　目的：探讨TRPC3在LPS诱导小鼠ASMCs增殖中的作用及可能机制。<br>　　方法：原代培养小鼠ASMCs，采用MTT法检测小鼠ASMCs增殖程度，Western blot检测小鼠ASMCs中TRPC3蛋白的表达变化，钙影像检测小鼠ASMCs内钙浓度（[Ca2+]i）变化，全细胞膜片钳检测小鼠ASMCs中NSCC电流变化，siRNA转染沉默小鼠ASMCs的TRPC3基因。<br>　　结果：①LPS（0.1-10μg/ml）作用ASMCs24h和48h，均可剂量依赖性地促ASMCs胞增殖，LPS（10μg/ml，48h）作用更加明显；非选择性TRPC3阻断剂GdCl3（3μM）和TRPC3抗体（1:200）均可明显抑制LPS促ASMCs增殖作用。②LPS可明显使ASMCs中TRPC3表达水平、NSCC电流幅度增高；GdCl3可显著抑制LPS诱导的TRPC3蛋白上调，GdCl3及TRPC3抗体均可明显抑制LPS诱导的NSCC电流增加。③GdCl3可明显抑制急性给予LPS对ACh（100μM）诱导ASMCs钙反应的升高作用；LPS（10μg/ml，48h）预处理ASMCs，可明显使静息[Ca2+]i及ACh诱导的ASMCs钙反应增加，GdCl3及TRPC3抗体均可明显抑制这种作用。④TRPC3siRNA（30μM，72h）转染可使ASMCs的TRPC3蛋白表达下降约70％，也可显著抑制正常ASMCs增殖及LPS促ASMCs增殖作用。⑤TRPC3siRNA转染可明显抑制LPS诱导TRPC3蛋白表达增高及NSCC电流增加。⑥TRPC3siRNA转染可明显抑制LPS预处理诱导的静息[Ca2+]i及ACh诱导ASMCs钙反应升高作用。<br>　　结论：该部分研究发现LPS可明显促进ASMCs增殖，同时可明显使TRPC3蛋白表达及NSCC电流幅度增高，促进ASMCs静息[Ca2+]i及ACh诱发的钙反应升高；且这些效应可被Gd3+、TRPC3抗体或TRPC3基因沉默所抑制。表明：LPS可能通过上调TRPC3蛋白表达及其编码的NSCC电流增加，诱导[Ca2+]i升高，最终促进ASMCs增殖。<br>　　第二部分：TRPC3在ACh诱导气道平滑肌细胞增殖中的作用。<br>　　目的：探讨TRPC3在ACh诱导小鼠ASMCs增殖中的作用及潜在机制。<br>　　方法：原代分离培养小鼠ASMCs，分别用MTT法检测小鼠ASMCs活性，Western blot检测小鼠ASMCs中TRPC3蛋白表达变化，钙影像检测小鼠ASMCs内钙（[Ca2+]i）变化，全细胞膜片钳检测小鼠ASMCs中NSCC电流变化，siRNA转染沉默小鼠ASMCs的TRPC3基因。<br>　　结果：①ACh(0.001-1000μM)作用ASMCs24h和48h，可时间、剂量依赖性地促ASMCs增殖，ACh(100μM，24h)作用比较明显；非选择性TRPC3阻断剂GdCl3（3μM）和TRPC3抗体（1:200）均可明显抑制ACh促ASMCs增殖作用。②ACh可明显使TRPC3表达水平及NSCC电流幅度升高，GdCl3可显著抑制ACh诱导TRPC3蛋白表达上调；GdCl3及TRPC3抗体可明显抑制ACh诱导的NSCC电流增加。③GdCl3可明显抑制急性给予ACh对KCl（100 mM）诱导钙反应的升高作用；ACh（100μM，24h）预处理可明显使静息[Ca2+]i及KCl诱导的ASMCs钙反应增加，GdCl3及TRPC3抗体均可显著抑制ACh的作用。④TRPC3siRNA（30μM，72 h）转染可使TRPC3蛋白表达下降约70%，也可显著抑制ACh促ASMCs增殖作用及正常情况下ASMCs增殖作用。⑤TRPC3siRNA转染可明显抑制ACh诱导ASMCs中TRPC3蛋白表达增高及NSCC电流增加。⑥TRPC3siRNA转染可明显拮抗ACh预处理引发的静息[Ca2+]i升高及KCl诱导钙电流升高。<br>　　结论：通过该部分研究发现：ACh预处理ASMCs可明显促进其增殖，并通过上调TRPC3表达、升高NSCC电流，进而导致ASMCs静息[Ca2+]i及KCl诱发的钙反应升高；而ACh的这些效应可被Gd3+、TRPC3抗体或TRPC3基因沉默所抑制。表明：ACh可能通过上调TRPC3表达，增大其介导的NSCC电流，导致[Ca2+]i升高，进而发挥促ASMCs增殖作用。<br>　　结论：TRPC3介导的[Ca2+]i变化在LPS及ACh诱导ASMCs增殖中均发挥重要作用，可能是干预气道重构的潜在靶点。