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摘要第一部分人端粒酶逆转录酶基因重组慢病毒载体的构建及鉴定<br>　　【目的】建立含有hTERT基因的重组慢病毒载体，进一步鉴定构建的载体是否正确。扩增慢病毒颗粒的数量，并检测浓缩后的病毒滴度，以便用于下一步的研究——基因修饰大鼠EPCs。<br>　　【方法】采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）的方法获取hTERT基因的全长片段，并大量扩增。AgeI和NheI内切酶处理 GV341质粒使其在特定酶切位点断裂，从而线性化。在交换酶的作用下，将获得的hTERT基因片段与线性化GV341质粒交换连接，产生重组质粒。将这些重组质粒导入制备好的感受态细胞（由大肠杆菌制备）中，在含有氨苄青霉素的培养基中培养扩增。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定单克隆菌落中含有的质粒，有 hTERT基因表达即为阳性克隆。检测这些初步鉴定为阳性菌落中质粒的核苷酸序列，并将结果与 hTERT基因序列进行比较，两者的核苷酸序列完全相同，表示成功构建了hTERT基因重组质粒。大量扩增且纯化hTERT基因重组质粒和相应的辅助质粒（pHelper1.0和2.0）。在转染试剂和Opti-MEM的辅助下，三种质粒一起转染293T细胞，合成病毒颗粒。2天后，上清滤去细胞残渣，离心超滤获取浓缩的病毒液。制备好的病毒液处理293T细胞，使病毒转染293T细胞后，利用含适当浓度的筛选药物（嘌呤霉素）的培养基孵育，在显微镜下监测细胞的状态，计算病毒的滴度。<br>　　【结果】核苷酸序列检测结果显示质粒与 hTERT基因的序列吻合，构建的重组质粒中的目的基因序列完全正确。利用293T细胞合成了大量的慢病毒颗粒，利用嘌呤霉素筛选处理，确定浓缩后病毒的最终滴度为2×108 TU/ml。<br>　　【结论】我们成功建立了含有hTERT基因的重组慢病毒载体，并且合成量较大且浓度高，可顺利的用于我们的下一步研究——hTERT基因修饰EPCs。<br>　　第二部分人端粒酶逆转录酶基因修饰大鼠内皮祖细胞<br>　　【目的】将hTERT重组慢病毒载体转染大鼠EPCs，探讨外源性hTERT基因在大鼠EPCs内的表达及对大鼠EPCs的影响。<br>　　【方法】采用密度梯度离心法原代分离培养大鼠EPCs，细胞免疫荧光方法检测表面标志CD31、CD34、CD133和血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2）在EPCs中的表达，Western blot法检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达。在特定的诱导培养基条件下将大鼠EPCs向平滑肌细胞和脂肪细胞定向分化。当感染复数（multiplicity of infection, MOI）为50时，将hTERT重组慢病毒载体或阴性对照病毒载体转染大鼠EPCs，得到EPCs-hTERT或EPCs-control。利用嘌呤霉素筛选转染后的大鼠EPCs得到阳性克隆。免疫荧光法、Western blot及Real-time PCR法检测hTERT及大鼠端粒酶逆转录酶（rat telomerase reverse transcriptase, rTERT）在EPCs-hTERT中的表达。端粒重复序列扩增（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）法检测EPCs-hTERT的端粒酶活性。为进一步了解 hTERT过表达对大鼠 EPCs的影响，细胞计数试剂盒（cell counting kit-8, CCK-8）法及5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）法检测 EPCs-hTERT的增殖能力。二氯二氢荧光素二乙酸酯（dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA）荧光探针检测EPCs-hTERT内的ROS水平。将EPCs-hTERT在氧化应激条件下培养，CCK-8法检测EPCs-hTERT的抗氧化应激能力。<br>　　【结果】原代分离培养出大鼠 EPCs。大鼠 EPCs表达 CD31、CD34、 CD133和VEGFR-2，阳性率分别为（96.8±0.5）％、（97.2±1.4）%、（92.8±5.3）%和（91.5±3.7）%。Western blot可检测到大鼠EPCs内eNOS的表达。多向诱导分化鉴定结果显示，大鼠EPCs可定向诱导分化为脂肪细胞（油红O染色阳性）及平滑肌细胞（α-平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色阳性）。慢病毒转染后，EPCs-hTERT内的hTERT基因在mRNA和蛋白水平的表达显著升高，并对rTERT的表达无影响。免疫荧光检测可见EPC-hTERT内的TERT蛋白表达于细胞核及细胞浆内，同时flag蛋白表达于细胞浆内，说明hTERT表达于细胞浆内。TRAP端粒酶活性检测结果显示，EPCs-hTERT的端粒酶活性显著升高。CCK-8法和EdU法结果显示，EPCs-hTERT的增殖能力显著强于EPCs和阴性对照病毒转染的EPCs（EPCs-control）。EPCs-hTERT内ROS水平较低，且在氧化应激条件下培养，EPCs-hTERT的存活率显著高于EPCs和EPCs-control。<br>　　【结论】成功分离并培养大鼠EPCs。hTERT基因重组慢病毒转染后，EPCs-hTERT端粒酶活性升高，且具有较强的增殖能力和抗氧化应激能力。<br>　　第三部分EPCs-hTERT对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制研究<br>　　【目的】探讨阴茎海绵体内注射 EPCs-hTERT是否能够改善糖尿病 ED大鼠勃起功能，并对可能机制进行探索。<br>　　【方法】利用腹腔内注射链脲佐菌素（60mg/kg）的方法建立大鼠糖尿病模型，并进一步采用阿扑吗啡（apomorphine, APO）实验筛选糖尿病ED大鼠。将30只SD雄性大鼠分为5组：正常对照组、糖尿病ED组、采用EPCs治疗的糖尿病ED组（EPCs组）、采用 EPCs-control治疗的糖尿病 ED组（EPCs-control组）、采用 EPCs-hTERT治疗的糖尿病ED组（EPCs-hTERT组）。2周后电刺激海绵体神经检测每组的勃起功能，并计算海绵体内压（intracavernous pressure, ICP）与平均动脉压（mean artery pressure, MAP）的比值。免疫荧光法检测阴茎组织内平滑肌含量和移植的EPCs的存活量。采用 Masson’s染色检测海绵体内纤维的含量。TUNEL法检测海绵体内细胞凋亡情况。Western blot法检测海绵体内转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）/Smad2/3通路、Bcl-2、Bax、eNOS、磷酸化eNOS（phospho-eNOS, p-eNOS）和神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）的表达情况。分别采用ELISA法和硝酸盐还原法测定大鼠阴茎海绵体组织中cGMP浓度和细胞内NO浓度。<br>　　【结果】经 EPCs和 EPCs-control治疗后，糖尿病 ED大鼠的勃起功能显著改善。EPCs-hTERT组的ICP/MAP比值显著高于EPCs和EPCs-control组。免疫荧光检测发现阴茎组织内的平滑肌含量及EPCs-hTERT存活量明显多于EPCs或EPCs-control组。Masson’s染色显示EPCs-hTERT组的海绵体内纤维含量显著降低，且TGF-β1/Smad2/3通路的表达显著降低。与EPCs和EPCs-control组相比，EPCs-hTERT组阴茎海绵体内凋亡水平及Bax/Bcl-2比值均较低。EPCs-hTERT组的海绵体内NO、cGMP含量和eNOS、p-eNOS及nNOS表达水平显著高于糖尿病ED组。<br>　　【结论】EPCs-hTERT可显著改善糖尿病ED大鼠的勃起功能，其机制可能为EPCs-hTERT在阴茎海绵体内存活量增多，并进一步减轻阴茎海绵体纤维化、降低组织内细胞凋亡水平和增加NO合成。