摘要目的:肾小管管周毛细血管内皮细胞向间充质转分化(EndMT)是新近发现的肾间质肌成纤维细胞的重要来源,其发生机制与内皮细胞紧密连接失去功能密切相关。研究表明蛋白丝/苏氨酸磷酸酶2A(PP2A)的催化亚单位C(PP2Ac)酪氨酸位点硝基化可激活 PP2A并能下调紧密连接连接蛋白(Occludin)丝/苏氨酸位点磷酸化,从而参与内皮细胞紧密连接的功能调控。本研究探讨 PP2Ac酪氨酸核心位点硝基化对内皮细胞紧密连接的影响,并阐明该位点是肾小管管周毛细血管EndMT的重要调控分子,参与进行性肾间质纤维化,为探索防治肾间质纤维化进行性发展的新治疗靶点提供实验依据。<br> 方法:体外构建硝基化反应体系,用过氧化亚硝酸盐(Peroxynitrite)刺激重组的PP2Ac蛋白,western blotting收集对照组和刺激组中的蛋白行质谱检测,分析PP2Ac酪氨酸发生硝基化的具体位点。对上述硝基化位点进行计算机模拟分析以明确各位点空间暴露程度从而确定调控PP2A活性的核心位点。同时构建、合成以核心位点为中心的底物模拟多肽和对照多肽,体外实验中验证该多肽对EndMT的干预作用,体内实验首先应用活体成像技术检测多肽在小鼠体内的分布以及代谢状态,然后通过尾静脉联合腹腔多肽注射观察该多肽在UUO小鼠模型中对管周毛细血管EndMT的干预效应。<br> 结果:质谱检测分析PP2Ac发生硝基化的具体位点有Y284/267/265/218/130/127。在这六个位点中,Y127在蛋白质空间结构、相邻氨基酸电荷分布上具有更稳定的空间表位优势,在 PP2Ac活化过程中起核心作用。以127位点为中心构建及合成的可穿透性底物模拟多肽和对照多肽能够抑制TGF-β1诱导的EndMT。体外试验中,多肽在肝脏和肾脏中具有较高的药物积聚;较对照多肽,底物模拟多肽可明显抑制Occludin去磷酸化,减少EndMT发生,稳定外周毛细血管结构并部分减轻肾间质纤维化。<br> 结论:以 PP2Ac Y127为核心的底物模拟多肽可有效干预内皮细胞转分化,是肾间质纤维化治疗的潜在生物靶点。
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