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摘要高迁移率簇蛋白1（High mobility group box-1 protein，HMGB1)是一种存在于几乎所有真核生物细胞内的保守的染色体结合蛋白，在胞内，它能够与 DNA直接相结合，或者与一些调节性的蛋白以及与DNA形成复合物，增强转录因子（如NF-κB）与靶基因相结合，从而激活靶基因的转录；HMGB1还可以通过主动分泌或被动释放到细胞胞外，作为一种炎症因子促进炎症的发生与发展。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群异质性的未成熟的细胞群体，在肿瘤和炎症等病理过程中起着重要的免疫负调节作用。有研究报道，在急性或慢性炎症过程中 MDSCs募集均增多，并且能发挥抑制炎症的作用；采用外源性 HMGB1刺激 MDSCs能通过激活下游 NF-κB通路来增强其免疫抑制功能，但是，MDSCs胞内自身表达 HMGB1对其影响尚不清楚。故本课题拟采用 DSS诱导的小鼠急性肠炎模型，通过 siRNA干扰肠炎小鼠 MDSCs内源性 HMGB1的表达，从而研究胞内HMGB1对 MDSCs免疫抑制功能的影响及其相关的分子机制，为临床上肠炎等炎症性疾病的治疗提供新的理论依据和线索。<br>　　第一部分干扰HMGB1表达对MDSCs免疫抑制功能的影响及其分子机制研究<br>　　方法:<br>　　1.构建 DSS诱导的小鼠急性肠炎模型，分离纯化其脾脏中 MDSCs，运用Western Blot和 ELISA技术检测小鼠肠炎各时期 MDSCs的百分比、是否分泌HMGB1，并利用其体外培养上清液刺激RAW264.7细胞，采用RT-PCR技术验证其分泌的HMGB1是否具有促炎活性。<br>　　2.设计并合成 HMGB1的siRNA序列，通过瞬时转染干扰 MDSCs内源性HMGB1的表达。<br>　　3.运用 CFSE增殖递减法检测 MDSCs对 T细胞增殖抑制功能的改变，运用ELISA、流式细胞术以及 RT-PCR等技术检测 MDSC功能相关分子 IL-10、TGF-β、iNOS、Arg-I和ROS的表达以及NO的产生。<br>　　4.运用流式细胞术检测各组 MDSCs分化成熟的表面标志 CD80，CD86和MHC-II类分子I-A/I-E的表达。<br>　　5.运用Western Blot技术检测各组MDSCs中NF-κB(p-p65及IκB-α)的表达；采用外源性HMGB1激活MDSCs中NF-κB的活性，从而验证MDSCs功能降低是否与NF-κB的失活有关。<br>　　结果:<br>　　1.小鼠在饮含2.5％DSS水后第8天急性肠炎症状（如粪便潜血、体重下降）明显，而在第19天肠炎症状基本消失；急性肠炎期脾脏及肠系膜淋巴结的MDSCs比例逐渐增高，且恢复期MDSCs比例显著高于急性期。<br>　　2.通过 Percoll密度梯度离心法及免疫磁珠法分离、纯化急性肠炎恢复期小鼠脾脏的MDSCs，其纯度可达95%以上；此 MDSCs能够分泌大量HMGB1，且后者能刺激RAW264.7细胞分泌促炎因子IL-1?和IL-6等。<br>　　3.转染 HMGB1的siRNA序列能够在 mRNA及蛋白水平上干扰 MDSCs胞内HMGB1表达。<br>　　4.瞬时干扰HMGB1表达后能降低MDSCs对T细胞增殖的抑制作用，主要通过降低MDSCs的iNOS和IL-10表达及NO产生，从而降低其免疫抑制功能。<br>　　5.瞬时干扰HMGB1表达后MDSCs表型趋于成熟，其表达CD80和MHC-II类分子I-A/I-E的水平显著增高。<br>　　6.运用 Western Blot技术检测 NF-κB的表达，结果发现瞬时干扰 HMGB1后MDSCs中 p65磷酸化水平以及 IκB-α降解显著降低；给予外源性 HMGB1刺激能逆转MDSCs的NF-κB活性，恢复MDSCs对T细胞增殖的抑制功能，增加其iNOS和IL-10表达及NO释放。<br>　　上述结果表明：干扰 MDSCs内源性HMGB1表达能显著降低 MDSCs的NF-κB活性，从而降低MDSCs的免疫抑制功能，促进其分化成熟。<br>　　第二部分干扰HMGB1表达能降低MDSCs对小鼠急性肠炎的抑制作用<br>　　方法:<br>　　1.分别在给小鼠饮含2.5%DSS水的第2、4和6天，经尾静脉将干扰HMGB1表达后的MDSCs回输至肠炎小鼠；<br>　　2.观察饮含2.5%DSS水后第8天急性肠炎小鼠的体征、结肠长度及结肠组织的病理改变；<br>　　3.运用 ELISA技术检测急性肠炎小鼠血清及结肠组织匀浆中的细胞因子 IL-1β、IFN-γ、IL-10及小分子NO等的变化。<br>　　结果:<br>　　1.相对于MDSCs输注对照组，过继输注瞬时干扰HMGB1的MDSCs组其小鼠急性结肠炎的体征以及结肠的病理损伤均明显加重；<br>　　2.相对于MDSCs输注对照组，过继输注瞬时干扰HMGB1的MDSCs组的急性结肠炎小鼠血清及结肠组织匀浆中抑炎因子IL-10及NO表达水平显著下降，而促炎因子IL-1β及IFN-γ表达水平显著升高。<br>　　上述结果说明：相对于 MDSCs输注对照组，过继输注干扰 HMGB1表达的MDSCs对DSS诱导的小鼠急性肠炎的抑制作用显著下降。<br>　　结论:<br>　　内源性HMGB1对维持MDSCs细胞的未成熟状态及免疫抑制功能必不可少，干扰内源性HMGB1的表达能够明显减弱MDSCs的NF-κB活性，促进MDSCs的分化成熟，导致 MDSCs免疫抑制功能显著下降，从而削弱其在小鼠急性肠炎中的抗炎作用。