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摘要目的：建立小鼠黑色素瘤肺转移模型，研究后续进入血液中的循环肿瘤细胞是否对于肿瘤肺转移病灶的形成具有促进作用，并且研究其具体的机制，为肿瘤治疗寻找新的靶点。<br>　　方法:（1）建立动物模型如下，小鼠在第0天接受尾静脉注射B16F1细胞，在第2天分别接受尾静脉注射PBS、B16F1细胞、MMC处理的肿瘤细胞、B16F0细胞或者MMC处理的B16F0细胞，第14天处死小鼠，通过肺转移肿瘤结节数目评价循环肿瘤细胞对黑色素瘤细胞 B16F1肺转移病灶形成的促进程度。（2）RT-PCR、Real-time PCR检测肺组织的Vegf、Mmp9基因的表达。（3）在MMP-9敲出小鼠建立此动物模型，通过肺转移肿瘤结节数目评价循环肿瘤细胞对黑素色瘤细胞 B16F1肺转移病灶形成的促进程度。（4）免疫组织化学检测肺组织中的中性粒细胞标志基因Ly6G，通过中性粒细胞数目评价肺组织中的中性粒细胞的浸润程度。（5）使用Ly6G单克隆抗体1A8清除小鼠系统中的中性粒细胞，流式细胞术检测外周血液中的中性粒细胞的清除效果，并且建立 B16F1肺转移动物模型，通过肺转移肿瘤结节数目评价中性粒细胞对转移病灶形成的影响。（6）使用免疫磁珠分离腹腔中性粒细胞，Real-time PCR检测分离的中性粒细胞的Mmp9以及Trail的基因表达，将分离的中性粒细胞与B16F1细胞混合，肌肉接种至小鼠右大腿，通过瘤重评价中性粒细胞对肿瘤生长的作用。（7）在此动物模型中，Real-time PCR检测肺组织的中性粒细胞趋化因子包括Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、Cxcl15、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5，中性粒细胞功能调控因子Il6、Csf3、Csf2以及中性粒细胞标志Ly6g基因的表达。（8）小鼠接受尾静脉注射PBS、MMC处理的B16F1细胞、MMC处理的或者未处理的B16F0细胞，分别在时间点5h、1d、3d、5d、7d，Western blot检测血清中的HMGB1以及HSP70的相对含量。（9）在此动物模型基础上，通过体内转染psTLR4清除系统中的TLR4配体，通过肺转移肿瘤结节的数目评价TLR4配体在肿瘤肺转移病灶形成的作用，同时免疫组化检测肺组织中的中性粒细胞的浸润情况，RT-RCR检测肺组织中的Mmp9基因的表达，Real-time PCR检测肺组织中的CXCL15、Il6以及Csf3基因的表达。（10）分离肺内皮细胞以及肺泡巨噬细胞，使用LPS以及肿瘤冻融上清DTC-Ms分别刺激这些细胞以及B16F1细胞，Real-time PCR检测Cxcl15（Il8）、Il6、Csf3基因的表达。（11）在此模型中，Real-time PCR以及 Western blot检测肺组织、肝脏组织以及脾脏组织中的S100A8、S100A9以及 SAA3的表达，Western blot检测肺组织间液中 S100A8、S100A9以及SAA3含量。分离的肺组织内皮细胞、肺泡巨噬细胞分别用LPS以及DTC-Ms刺激后，Western blot检测S100A8、S100A9以及SAA3的表达。<br>　　结果：（1）循环B16F1细胞或者循环的B16F0细胞对B16F1肺转移病灶的形成有着相同的促进作用，而 B16F0细胞不会在肺组织形成肿瘤病灶结节，也不会发生肺转移。那么循环的B16F0细胞可能通过影响转移病灶的微环境来影响转移病灶的形成的。（2）血管生成对于肿瘤发生和发展至关重要，其中VEGF和MMP-9是影响血管生成最重要的因子，结果显示循环的B16F0可以上调正常肺组织或者已经转移了B16F1细胞的肺组织中的Mmp9基因的mRNA水平，而不会上调Vegf基因的表达。（3）在MMP-9敲出小鼠建立此模型，发现循环的B16F0细胞对B16F1细胞肺转移病灶的形成没有促进作用，并且相对于正常小鼠，并且 B16F1肺转移肿瘤病灶的形成明显被抑制。（4）肿瘤细胞表达 MMP-9，后来发现一些髓源性细胞也表达MMP-9，其中中性粒细胞表达的MMP-9是最重要的来源，因此使用免疫组织化学检测肺组织的中的中性粒细胞的标志蛋白Ly6G，发现循环的B16F0细胞可以导致中性粒细胞的在肺组织的浸润。（5）为了验证浸润的中性粒细胞是否是 MMP-9的最重要的来源以及循环肿瘤细胞促进肺转移病灶的主要影响因素，我们通过抗体1A8清除中性粒细胞后，RT-PCR检测肺组织的Mmp9基因的表达，发现肺组织的Mmp9的mRNA水平因为中性粒细胞的清除而被下调，同时清除中性粒细胞后，循环的B16F0细胞对B16F1肺转移病灶形成的促进作用也没消除了（6）为了进一步了解中性粒细胞的功能，混合接种实验结果显示循环的B16F0细胞存在下的中性粒细胞的功能发生改变，促进B16F1细胞在肌肉中成瘤，Real time结果显示循环的B16F0细胞可以上调中性粒细胞Mmp9基因的mRNA水平，下调Trail基因的mRNA水平。（7）循环的B16F0细胞能够引起肺组织的中性粒细胞的浸润并且可以改变中性粒细胞的功能，为了了解其具体的机制，使用Real time PCR检测肺组织的中性粒细胞的趋化以及功能调控的各种因子，包括 CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL15、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、GM-CSF、IL-6以及G-CSF等，Real-time PCR结果表明循环的B16F0细胞可以导致肺组织中的CXCL15、IL-6、G-CSF的表达上调。（8）由于循环肿瘤细胞会发生死亡，死亡的肿瘤细胞会释放损伤相关分子模式（DAMP），例如HMGB1、HSP70等，这些DAMP可以作为TLR4的内源性的配体。结果显示，B16F0细胞释放 HMGB1以及 HSP70在血液中可以持续较长的时间，而 MMC处理的B16F1细胞或者B16F0细胞释放的HMGB1以及HSP70在血液中持续的时间较短。(9)通过体内转染表达可溶性的TLR4清除这些 TLR4配体，我们发现循环的B16F0细胞对于B16F1肺转移病灶形成的促进作用被消除了，同时使用免疫组织化学检测肺组织的中性粒细胞的浸润情况，发现清除 TLR4配体的可以明显降低循环 B16F0细胞诱导的肺组织中的中性粒细胞的浸润。RT-PCR检测肺组织中的Mmp9基因的mRNA水平，发现肺组织中的Mmp9基因的mRNA水平因为转染了sTLR4而被下调。同时Real-time PCR结果显示清除TLR4配体可以明显降低循环B16F0细胞诱导的Cxcl15、Il6以及Csf3基因的mRNA水平的上调。（10）为了了解循环的循环 B16F0细胞到底影响肺组织中的哪些细胞，我们通过分离了肺组织中的两种主要的细胞，肺内皮细胞以及肺泡巨噬细胞，细胞刺激实验表明，LPS以及肿瘤冻融上清上调肺内皮细胞，肺泡巨噬细胞以及肿瘤细胞的Cxcl15、Il6以及Csf3基因的mRNA水平。（11）炎症蛋白S100A8、S100A9以及 SAA3是可以激活 TLR4信号通路的配体，在此模型中，Real-time PCR和Western blot结果表明，循环的B16F0细胞可以上调肺组织中S100A8、S100A9以及SAA3的表达，同时Western blot结果显示肺组织间液也检测到S100A8、S100A9以及SAA3，此外LPS以及DTC-Ms可以诱导肺组织内皮细胞、肺泡巨噬细胞表达S100A8、S100A9以及SAA3的上调。<br>　　结论：本文发现了循环肿瘤细胞不仅仅是转移病灶细胞的重要来源，还可以影响转移病灶的微环境来促进已经转移的肿瘤形成肿瘤病灶，即循环肿瘤细胞不通过血液转移种植到肿瘤转移病灶。我们揭示了循环肿瘤细胞可以通过释放 TLR4配体促进转移病灶的基质细胞表达中性粒细胞趋化因子和功能调节因子，促进中性粒细胞的浸润，并且使得中性粒细胞从抑瘤向促瘤的方向转变。这些中性粒细胞主要是通过表达MMP-9影响转移病灶血管生成，从而影响转移到肺组织的肿瘤细胞的种植。此外循环肿瘤细胞释放的TLR4配体能够影响肺组织基质细胞表达 SA100A8，SA100A9以及SAA3分子，此外，这些分子本身可以作为TLR4的内源性的配体放大激活TLR4信号，同时对于中性粒细胞也有一定的趋化能力。因此，抑制TLR4信号可以有效抑制循环肿瘤细胞对肿瘤转移病灶形成的促进作用，可能是肿瘤治疗的一个重要的靶点。