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摘要目的：以牛Ⅱ型胶原乳化剂结合人工气候箱模拟寒湿环境诱导的RA（寒湿痹阻证）SD大鼠为类风湿关节炎动物模型，观察风湿宁胶囊（FSN）对模型大鼠的足肿胀度、关节指数、关节病理、后肢趾温、血流变、Th17/Treg细胞比例、Ⅱ型胶原抗体、相关细胞因子和JAK2/STAT3信号通路等的影响，以期阐明其作用的分子机制。以原代培养的CIA-FLS细胞为研究对象，观察FSN含药血清对其增殖、凋亡、JAK2/STAT3信号通路、负反馈调节因子、VEGF和RANKL的影响，探讨FSN胶囊含药血清可能的作用机制。<br>　　方法：在体实验研究：采用随机数字表法将SPF级SD大鼠分为以下6组：正常组、模型组、FSN低剂量组、FSN中剂量组、FSN高剂量组和Tofacitinib组，其中除正常组外均采用牛Ⅱ型胶原乳化剂结合人工气候箱诱导对大鼠进行造模。成模后第1天开始给予相应药物灌胃，FSN高剂量组（1.32g/kg），FSN中剂量组（0.66g/kg），FSN低剂量组(0.33g/kg），Tofacitinib组（15mg/kg），正常组和模型组用等量的生理盐水进行灌胃，其中各剂量组FSN每日1次，Tofacitinib每日1次，均连续28天。在各组药物干预后，采用电子秤称量每只大鼠的体重、采用温度快速筛检仪检测大鼠后肢趾温；采用水容积法测量大鼠下肢容积；采用关节炎指数评分法评价关节炎治愈程度；采用病理石蜡切片HE染色法观测大鼠关节情况并计分；采用全自动血流变仪检测大鼠外周血中全血高切及低切粘度；采用流式细胞仪检测大鼠外周血中辅助性T细胞亚群Th17、Treg细胞的数量；采用ELISA法检测大鼠外周血中牛Ⅱ型胶原抗体、IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A和TGF-β1等细胞因子的含量；采用免疫荧光技术观察大鼠滑膜组织中JAK2和STAT3的表达情况；采用Real-time PCR和Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察JAK2/STAT3及其负反馈调节因子SOCS3的表达。<br>　　离体实验研究：①采用组织块培养法对模型大鼠滑膜组织中CIA-FLS细胞进行了原代培养，并对其形态学进行鉴定；采用免疫荧光技术对CIA-FLS细胞表面标记物Vimentin进行了观察；采用Real-time PCR和免疫荧光技术分别对FLS和CIA-FLS细胞中JAK2、STAT3的含量进行检测。②将第3代CIA-FLS细胞分为5组：空白血清对照组、Tofacitinib含药血清组、20％FSN含药血清组、10%FSN含药血清组和5%FSN含药血清组，对各组CIA-FLS细胞先分别饥饿24小时后再加入相应血清干预。采用CCK-8法检测各组血清干预24、48、72h后对CIA-FLS细胞增殖状态的影响；采用Annexin V-FITC/PI双染法通过流式细胞仪观察各组血清干预48h后对CIA-FLS细胞早期和晚期凋亡情况的影响。③将第3代CIA-FLS细胞分为5组：空白血清对照组、空白血清+IL-6组、Tofacitinib含药血清+IL-6组、20%FSN含药血清+IL-6组、10%FSN含药血清+IL-6组和5%FSN含药血清+IL-6组，先对各组CIA-FLS细胞饥饿24h，再加入各组血清干预24h，最后加入IL-6刺激4h。采用Real-time PCR和Western blot技术分别从基因和蛋白的角度来观察各组CIA-FLS细胞中P-JAK2、P-STAT3及其负反馈调节因子SOCS1和SOCS3的含量；采用Real-time PCR技术分别对各组CIA-FLS细胞中VEGF和RANKL的表达情况进行检测。<br>　　结果：在体实验研究：模型大鼠后肢（膝、踝、足趾关节）明显肿胀，四肢厥冷，饮水及摄食量降低，嗜睡，皮毛枯槁无泽，发黄卷曲甚至脱落，行动缓慢，精神不振，蜷缩弓背少动，甚至大便稀溏，造模过程中体重增加不明显，部分大鼠出现耳色暗红，爪尾部紫暗肿胀等血瘀的症候。对模型大鼠进行风湿宁胶囊灌胃给药后，其精神状态出现不同程度的好转，饮水及摄食量有所增加，大便稀溏状况改善，四肢关节肿胀有所好转，趾温渐复，行动迟缓状况得到改善，体毛脱落减少，体重增长较模型组更快。用药28天后，与模型组相比，风湿宁胶囊各剂量组大鼠体重都有不同程度的增加（P＜0.05），大鼠后肢关节肿胀度降低明显（P＜0.05），大鼠关节炎症积分都出现不同程度的下降（P＜0.05），大鼠外周血中Ⅱ型胶原抗体含量呈现出不同程度的降低（P＜0.05）；风湿宁胶囊中剂量组大鼠外周血全血低切还原粘度显著降低（P＜0.05）；在关节病理方面，风湿宁胶囊各剂量用药组干预后，滑膜细胞增生、血管数目以及浸润的单核及淋巴细胞都可见不同程度的减少，其病理积分也出现相应的变化；在免疫调节方面，风湿宁胶囊可以调节模型大鼠外周血中Th17/Treg细胞的比例（P＜0.05），降低IL-1β、IFN-γ和IL-17A等细胞因子的含量（P＜0.05），提高IL-4、IL-10和TGF-β1等细胞因子的表达（P＜0.05）；在JAK2/STAT3信号通路方面，风湿宁胶囊能够抑制模型大鼠滑膜组织中JAK2/STAT3信号通路的过度表达，上调负反馈调节因子SOCS3的表达（P＜0.05）。<br>　　离体实验研究：①第三代CIA-FLS形态均一，呈梭型，免疫荧光染色后细胞中可见Vimentin蛋白红色荧光的表达。FLS细胞和CIA-FLS细胞中JAK2/STAT3的Real-time PCR和免疫荧光检测结果表明：与FLS细胞相比，CIA-FLS细胞中JAK2、STAT3的含量明显增多，差异显著（P＜0.05）。②CCK-8法检测结果表明在24h，各浓度（20%、10%和5%）的FSN含药血清对CIA-FLS增殖未出现明显的作用，而Tofacitinib含药血清已经对CIA-FLS增殖出现抑制。在48h，Tofacitinib含药血清、20%FSN含药血清和10%FSN含药血清干预对CIA-FLS细胞的增殖都表现出了不同程度的抑制。在72h，FSN各浓度（20%、10%和5%）含药血清和Tofacitinib含药血清对CIA-FLS增殖均可见显著的抑制效果，其中20%风湿宁胶囊含药血清效果最好。从24、48和72h这三个时间点来观察，风湿宁胶囊含药血清对CIA-FLS细胞增殖的抑制作用呈现出一定的时效关系。Annexin V-FITC/PI双染检测结果表明风湿宁胶囊含药血清各浓度（20%、10%和5%）组都不同程度的提高了细胞总凋亡率，其中20%风湿宁胶囊含药血清组对CIA-FLS凋亡促进作用最强。结果中Annexin V阳性同时PI阴性细胞所占比例较低，而PI阳性同时Annexin V阳性细胞所占比例较高可能是由于含药血清干预时间较长导致多数CIA-FLS细胞进入了晚期凋亡。③与空白血清对照组相比，空白血清+IL-6组中CIA-FLS细胞JAK2、STAT3的mRNA含量和蛋白表达都有所增多（P＜0.05），同时该通路相关细胞因子VEGF和RANKLmRNA的含量也增加（P＜0.05），tofacitinib含药血清+IL-6组CIA-FLS细胞JAK2、STAT3的mRNA含量和蛋白表达都明显下降（P＜0.05），该通路相关细胞因子VEGF和RANKLmRNA的含量也明显减少（P＜0.05）。FSN含药血清+IL-6组CIA-FLS细胞JAK2、STAT3的mRNA含量和蛋白表达与模型组相比有不同程度的下降（P＜0.05），20%FSN含药血清+IL-6组CIA-FLS细胞SOCS3mRNA含量和蛋白表达上升（P＜0.05），10%FSN含药血清+IL-6组中VEGF和RANKLmRNA的含量不同程度的减少（P＜0.05）。<br>　　结论：①风湿宁胶囊对模型大鼠多发性关节炎症具有明显的治疗作用，其机制可能是风湿宁胶囊通过调节了模型大鼠外周血中Th17/Treg失衡的比例、改善了相关细胞因子的含量和抑制了JAK2/STAT3信号通路的过度激活从而产生了抗炎和免疫调节的作用。<br>　　②风湿宁胶囊含药血清对CIA-FLS细胞增殖的抑制及凋亡的促进可能是其治疗类风湿关节炎的机制之一。<br>　　③风湿宁胶囊含药血清可能通过对CIA-FLS细胞JAK2/STAT3信号通路的抑制作用进而影响了相关细胞因子VEGF和RANKL的表达，这也可能是风湿宁胶囊能够改善类风湿关节炎血管翳形成和骨破坏的机制之一。